玉米淀粉含量测定影响因素分析

沙米西努尔·牙森,李晓荣,蔡大润,李 娟,刘志刚,杨 洋,李 波,陈勋基,陈果

(新疆农业科学院核技术生物技术研究所,乌鲁木齐 830091)

0 引 言

【研究意义】玉米 (ZeamaysL) 是重要的粮用、饲用和工业原料作物。玉米在生长发育中光合作用过程产生的过量葡萄糖以淀粉的形式储藏在淀粉体中并为植物种子、胚乳和块茎的生长提供能源[1]。在玉米籽粒中,淀粉是玉米产量和品质的决定因素[2]。随着直链淀粉的需求不断增加,现有直链淀粉含量测定标准尚不能满足玉米直链淀粉测定需求,在玉米淀粉检测中,直链淀粉含量的测定有着严格的标准和要求,多是采用仪器法来测定,包括碘染色法、近红外分析法,分析方法包括单波长分光光度计检测和双波长分光光度计检测。其中双波长分光光度计算方法准确度较高。与水稻、小麦不同,高直链淀粉玉米含量通常大于50%,分析玉米专用的直链淀粉含量鉴定方法对于专用淀粉加工产业具有重要意义。【前人研究进展】淀粉是由数百上千的单糖分子连接聚合而成的多聚体[3],主要位于种子、块茎作物以及茎、叶、果实甚至花粉中[4]。根据分子结构差异淀粉分为直链淀粉(Amylose)和支链淀粉(Amylopectin)[5]。直链淀粉和碘分子形成淀粉-碘螺旋包合物并发生显色反应,显色程度主要由链长决定[6]。当直链淀粉的链长>80时,光的最大吸收波长大620 nm,直链淀粉螺旋状卷曲越多束缚的碘离子数越多,直链淀粉与碘的显色反应呈现深蓝色。而支链淀粉遇碘液时碘分子只能与支链淀粉分支点外部的20几个葡萄糖基结合,故呈红到紫红色。pH值对淀粉显色反应影响也很大,淀粉溶液在不同的pH值下显色情况也不同。淀粉与碘的显色反应在pH值为3～5的弱酸性溶液中进行最灵敏,在pH<8的弱碱性溶液中次之,在pH>9的碱性溶液中不显色[7]。在强酸性溶液中,反应呈现深蓝(直链淀粉)或红褐色(支链淀粉),发生不同显色反应的原因是淀粉在强酸中会发生水解,产生糊精等,在不同的直链淀粉或支链淀粉溶液中糊精和碘分子作用呈现深蓝色或红褐色,在强碱性溶液中,碱将歧化成次碘酸盐和碘化物,基本无单质碘的存在,因而不显色;在弱酸性溶液中,碘不参与歧化反应[8]。【本研究切入点】玉米淀粉是重要的食品和工业原料,高直链淀粉玉米需求扩大,但目前尚无专门针对玉米直链淀粉检测标准。需研究高直链玉米、普通玉米以及糯玉米等3种淀粉溶液中直链淀粉和支链淀粉含量、pH值、波长、吸光度、吸光谱、淀粉颗粒结构等变化。【拟解决的关键问题】采用双波长分光光度计测定不同玉米中直链淀粉、支链淀粉含量,比较不同玉米中淀粉溶液参比波长、吸光度和吸光谱,分析影响玉米淀粉含量测定的因素,确定使用双波长测定高直链淀粉玉米中直链淀粉的含量。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 玉 米

高直链淀粉玉米、糯玉米、普通玉米(均由新疆农业科学院核技术生物技术研究所实验室选育保藏)。

根据玉米籽粒淀粉工业加工用途,可以分为普通玉米,高直链淀粉玉米、糯玉米、高淀粉玉米,自交系B73属于马齿型普通玉米,糯玉米万糯2018籽粒中有较粗的蜡质状胚乳,较像硬质玉米和马齿型玉米有光泽的玻璃质(透明)籽粒。高直链淀粉玉米G423籽粒为无光泽半透明。高淀粉玉米HS19-1籽粒表现为蜡质状不透明。图1

图1 不同淀粉含量的玉米籽粒表型

1.1.2 仪器设备及试剂

离心机、pH测定仪、分光光度计、1 mol/L KOH、1 mol/L NaOH、1 mol/L HCl、1 mol/L乙酸,0.2%碘液。亚硫酸、无水乙醇、丙酮、双蒸水。

碘试剂:称取碘化钾2.0 g溶于少量蒸馏水,再加碘0.2 g,待溶解后用蒸馏水稀释并定容至100 mL。

1.2 方 法

1.2.1 淀粉提取

玉米籽粒中淀粉由直链淀粉和支链淀粉两种类型组成,普通玉米籽粒的直链淀粉和支链淀粉分别占总淀粉含量的22%～25%和75%～78%。高直链淀粉玉米是指直链淀粉含量均超过50%[9]。现有测定玉米不同淀粉使用国标水稻、玉米、谷子籽粒直链淀粉测定法(GB 7648-87),该方法为单波长分光光度计测量法,通过样品提取,绘制标准曲线,测定620 nm处吸光度。

将高直链玉米籽粒、普通玉米籽粒、糯玉米籽粒均15粒用体积分数0.25%的亚硫酸溶液(8 mL亚硫酸+192 mL蒸馏水)浸泡51 h,用小刀切除胚芽及剥去种皮,用研钵研磨,加水研磨成糊后经100 μm尼龙网过滤至50 mL的离心管。2 000r/min离心15 min,弃上清。沉淀中加0.2%的10 mL NaOH溶液混合均匀后,静置4 h。在4 000r/min离心10 min,去上清,用0.2%的NaOH溶液重复洗涤至上清无色。加15 mL丙酮,在4 000r/min离心10 min去上清通风橱内自然干燥后备用。

1.2.2 直链淀粉纯化

称量1 g玉米淀粉放置于含有10 mL DMSO水溶液的烧杯中(其中DMSO和蒸馏水的比例为4∶1),在用玻璃棒不断搅拌溶液,直至乳液状后,将烧杯放在60℃恒温水浴中持续搅拌30 min后,再加入2 mL正丁醇后直接在常温下放置。直至溶液中出现细针型沉淀后,以2 000 r/min、30 min的条件离心溶液。除上清,先加入2mL 2% NaCl,再缓慢加入2 mL正丁醇,并用涡旋振荡器使溶液均匀,再以2 000 r/min、30 min的条件离心溶液。重复6次以获得高纯度直链淀粉,用真空冷冻干燥机干燥沉淀后研磨并保存在干燥器中。

1.2.3 标准工作液制备

称取直链(支链)淀粉标准品0.1 g于100 mL烧杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;将烧杯置于60℃水浴中充分搅拌10 min,用蒸馏水定容至50 mL,即可得2 mg/mL浓度的直链(支链)淀粉工作液。

1.2.4 标准扫描液制备

取直链/支链淀粉标准工作液1、5 mL各置于100 mL烧杯中,加蒸馏水25 mL,以0.1 moL/L HCl溶液调pH值至3.5,再分别将溶液全部转移至50 mL容量瓶中,加0.5 mL碘试剂,加蒸馏水至刻度。静置10 min后摇匀后在分光光度计扫描两种淀粉标准液的吸收光普并确定两种淀粉的参比波长。

1.2.5 样品工作液制备

称取高直链玉米淀粉、普通玉米淀粉、和糯玉米淀粉各0.1 g于100 mL烧杯中,加10 mL 1 mol/L KOH;将烧杯置于60℃水浴中充分搅拌10 min,用蒸馏水定容至100 mL,即可得1 mg/mL浓度的工作液。

1.2.6 淀粉溶液pH和吸光度测定

取5 mL的1 mg/mL直链淀粉溶液和普通淀粉溶液以及糯淀粉溶液(每隔样品3次重复),分别加50 mL蒸馏水水稀释,加入1 mL,1 mol/L HCl溶液,在pH测定仪测定3个品种加入盐酸时的pH值并记录,再分别加1 mL碘试剂,用蒸馏水定容至100 mL,显色10 min后先用分光光度计扫描3种淀粉在400～800 nm处的吸收光谱并保存。再分别测定620、440、550和750 nm处的吸光度值。按同样的方法NaOH代替KOH,乙酸替代HCl(浓度和体积一致)测定各样品的pH、吸光度以及吸光普。

1.2.7 淀粉亚显微结构

将已提取纯化的高直链玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g装进2.0 mL的离心管中视为对照组。将高直链玉米淀粉和普通玉米淀粉各取0.2 g置于研钵中,各加2.0 mL 1 mol/L HCL并放置干燥箱干燥,干燥后的淀粉进行研磨并装进2.0 mL的离心管中。利用扫描电镜对两组样品进行分析。

样品处理时先将导电胶带黏结在样品座上,再均匀地把粉末样撒在上面,用洗耳球吹去未黏住的粉末,即可用电镜观察。操作过程中样品的厚度要均匀,表面要平整,且量不要太多,1 g左右即可。

1.2.8 稳定性

取1 mL的1 mg/mL直链淀粉溶液和支链淀粉溶液(每个样品3次重复),分别加50 mL蒸馏水水稀释,加入1 mL,1 mol/L 乙酸溶液,再分别加1 mL碘试剂,用蒸馏水定容至100 mL,显色10 min后测定支链淀粉和直链淀粉溶液每隔10 min后的吸光度。

1.3 数据处理

试验数据用GraphPad Prism 9和SPSS 19等软件处理。

2 结果与分析

2.1 不同淀粉含量玉米材料中籽粒表型

研究表明,普通玉米自交系B73直链淀粉含量为25%,支链淀粉含量为75.6%,高直链淀粉玉米材料G423直链淀粉含量为64.8%,支链淀粉含量为32.3%,糯玉米万糯2018直链淀粉含量为1.9%,支链淀粉含量为97.1%。图2

2.2 直链(支链)淀粉参比波长变化

研究表明,直链淀粉和支链淀粉的最高测定波长分别为620和550 nm,参比波长分别为750和440 nm。图3

图3 直链淀粉和支链淀粉的吸收光谱变化

2.3 乙酸和盐酸对淀粉溶液pH值的影响

研究表明,当3种淀粉溶液中加入乙酸时淀粉溶液的pH值在4.0 ～ 4.5;高直链玉米淀粉最高pH值为4.42,最低pH值为4.16,平均为4.30。普通玉米淀粉最高pH值为4.31,最低pH值为4.08,平均为4.20。糯玉米淀粉最高pH值为4.42,最低pH值为4.20,平均为4.31。而加入盐酸时淀粉溶液的pH值在2.3 ～ 2.6,高直链玉米淀粉最高pH值为2.65,最低pH值为2.39,平均为2.54。普通玉米淀粉最高pH值为2.6,最低pH值为2.43,平均为2.49。糯玉米淀粉最高pH值为2.58,最低pH值为2.43,平均为2.50。加入乙酸和盐酸后,三种淀粉溶液pH值显著下降,乙酸和盐酸对淀粉溶液pH值具有强烈的影响,其中乙酸对高直链玉米淀粉溶液pH值影响最大。图4

注:***表示(P < 0.001),每个圆点表示一个数据点

2.4 乙酸和盐酸对各淀粉溶液吸光度的影响

研究表明,在620 nm处高直链玉米淀粉溶液中加入乙酸时的吸光度平均值为0.843 9,而加入盐酸时为0.956 7,在440 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.308 3,加入盐酸时为0.365 9,在550 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.605 9,而加入盐酸时为0.757 7,在750 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.392 9,而加入盐酸时为0.499 4。

620 nm处普通玉米淀粉溶液中加入乙酸时的吸光度平均值为0.312 4,而加入盐酸时为0.405 0,在440 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.194 2,而加入盐酸时为0.266 4,在550 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.255 6,而加入盐酸时为0.353 0,在750 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.169 3,而加入盐酸时为0.220 0。

620 nm处糯玉米淀粉溶液中加入乙酸时的吸光度平均值为0.131 7,而加入盐酸时为0.163 0,在440 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.158 8,而加入盐酸时为0.186 9,在550 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.181 5,而加入盐酸时为0.225 5,在750 nm处加入乙酸时的吸光度平均值为0.031 7,而加入盐酸时为0.038 9。加入盐酸后3种淀粉溶液在这4个波长处的吸光度值均高于加入乙酸时的吸光度值,高直链玉米淀粉溶液吸光度值大于普通玉米、糯玉米淀粉溶液。图5

注:***表示(P< 0.001)。每个圆点表示一个数据点

2.5 乙酸和盐酸对各淀粉溶液吸光普的影响

研究表明,当高直链玉米淀粉里加入乙酸时淀粉溶液在620 nm处的吸光度约为0.82,而加入甲酸时吸光度为0.92、当普通玉米淀粉溶液中加入乙酸时620 nm的吸光度约为0.315,而加入甲酸时吸光度为0.395左右、当糯玉米淀粉溶液中加入乙酸时550 nm处吸光度约为0.163,而加入甲酸时吸光度为0.223左右,高直链玉米淀粉溶液的吸光谱是最高的,并且加入盐酸时的3种淀粉溶液的吸收峰高于加入乙酸时的吸收峰值。图6

注:A:直链淀粉;B:普通淀粉;C:支链淀粉

2.6 盐酸对普通玉米和高直链玉米淀粉颗粒结构的影响

研究表明,普通玉米淀粉分子呈不规则多面体形状,表面光滑,且具有一定数量的棱角,大部分体积较大,部分淀粉颗粒表面具有微小凹坑。而高直链玉米淀粉颗粒表面相对圆润,无明显棱角但有部分褶皱和小突起,并未见明显微小凹坑,大部分颗粒体积也相对较小,这些形态上的区别可能是直链淀粉与支链淀粉结晶结构不同导致的。与没有盐酸处理的普通玉米淀粉和高直链玉米淀粉相比,盐酸处理后的普通玉米淀粉和高直链玉米淀粉晶体微观结构有很大区别。具体表现为普通玉米淀粉颗粒膨大,表面凹凸不平,呈不规则形状,高直链玉米淀粉颗粒结构改变没有普通玉米剧烈。当淀粉溶液中加入盐酸后导致淀粉颗粒晶体结构发生变化,淀粉溶液pH值、吸光度、波长等一系列理化指标的变化。图7

注:B:高直链玉米淀粉亚显微结构×2000倍扫描照片;C:HCl处理后普通玉米淀粉亚显微结构2000倍扫描照片;D:HCl处理后高直链玉米淀粉亚显微结构2000倍扫描照片

2.7 支链淀粉和直链淀粉水溶液稳定性比较

研究表明,支链淀粉在前50 min的吸光度基本上一直,吸光值约为0.136,在60 min的时候吸光值为0.135(P> 0.05)。而直链淀粉溶液随着时间变化,吸光值变化呈现波动,前30 min吸光值增加,30 min后吸光值下降。在60 min内,直链淀粉吸光值波动范围(0.60～0.64,P> 0.05)比支链淀粉(0.135～0.136,P> 0.05)剧烈。支链淀粉水溶液比直链淀粉稳定。图8

注:A:支链淀粉;B:直链淀粉

3 讨 论

研究中3种淀粉溶液浓度、碘液中I-浓度以及盐酸、乙酸等溶液的浓度和体积一致,其中HCl是强电解质,乙酸是弱电解质,盐酸溶液中C(H+)= C(HCl),乙酸溶液中C(H+)9的碱性溶液中不显色。相同浓度和体积的盐酸和乙酸溶液中,盐酸中H+离子浓度大于乙酸中H+离子浓度,当淀粉溶液中加入等浓度、等体积的盐酸和乙酸后加盐酸时的淀粉溶液的pH值都明显小于加乙酸时的pH值(P< 0.001)。

加入盐酸的3种淀粉溶液吸光普和吸光度值也明显区别于加乙酸时的吸收光谱和吸光度值(P< 0.001),可能是因为淀粉螺旋卷曲内部主要包含H+离子具有疏水性,当淀粉螺旋卷曲内部的氢离子越多淀粉束缚碘,盐酸,乙酸等有机物的几率越高,试验过程中淀粉溶液中淀粉颗粒本身包含的氢离子和盐酸中的氢离子使淀粉溶液具有更高的吸光度和吸光普。

淀粉颗粒大多为椭圆形、球形、圆饼形、多角形以及其他不规则的形状[9]。研究通过电子扫描显微镜对普通玉米淀粉和高直链玉米淀粉进行淀粉亚显微结构比较并对经过盐酸处理的普通玉米淀粉颗粒和高直链玉米淀粉颗粒微观结构进行分析发现,普通玉米淀粉颗粒呈不规则多面体形状,淀粉颗粒表面具有一定数量的棱角,且光滑,大部分体积较大,部分淀粉颗粒表面具有微小凹坑,可能是因为淀粉粒形成过程中部分酶所引起的,而高直链玉米淀粉颗粒表面相对圆润,无明显棱角但有部分褶皱和小突起,并未见明显微小凹坑,大部分颗粒体积也相对较小,形态上的区别可能是两种玉米品种所包含的直链淀粉与支链淀粉结晶结构不同导致的。盐酸处理后普通玉米淀粉颗粒亚显微结构和高直链玉米淀粉颗粒晶体结构较没有盐酸处理的普通玉米淀粉颗粒晶体结构和高直链玉米淀粉晶体结构有很大区别,盐酸对淀粉颗粒结构影响很大。

稳定性试验结果表明直链淀粉和支链淀粉溶液每隔10 min的吸光度变化情况稳定性不一样。直链淀粉是一种微溶于热水的碳水化合物,而支链淀粉易溶于水,支链淀粉的水溶液远比直链淀粉稳定。直链淀粉含量测定实验中常用的测定方法是淀粉溶液中加入碘试剂10 min后测定样品的吸光度,因为随着时间样品中直链淀粉溶液的吸光度越不稳定导致测出来的淀粉含量不精确,测定直链淀粉含量过程中保证速度快、待测样品少,若样品多需分批测定来保证实验的可靠性。

4 结 论

高直链玉米、普通玉米和糯玉米中直链淀粉淀粉含量分别为64.8%、25%和1.9%,支链淀粉含量分别为32.3%、75.6%和97.1%。在酸性条件下,3种玉米淀粉溶液pH值均降低,其中乙酸对高直链玉米淀粉溶液pH值影响最大,盐酸处理后3种淀粉溶液吸光度值以及吸光谱均发生改变,尤其是直链淀粉吸光度及吸光谱高于支链淀粉,高直链玉米淀粉颗粒结构改变虽有变化,但没有普通玉米剧烈,直链淀粉水溶液没有支链淀粉水溶液稳定。