鸡粪中尿酸降解细菌的分离与鉴定

王 瀚,卓平清, 田凤鸣 ,王弋博

(1.陇南师范高等专科学校 农林技术学院,甘肃 陇南 742500;2.天水师范学院 生物工程与技术学院,甘肃 天水 741000)

随着我国经济的高速发展及人民生活水平的不断提升,规模化养殖业发展迅速.有数据表明,截止2022年8月我国蛋鸡存栏量为11.83亿只[1].在鸡的工业化养殖过程中,鸡粪的堆积及处理是养殖业面临的重要问题之一.大量露天的鸡粪堆积,不仅会对环境造成较大危害,而且其中所含的各类病原菌和含氮废物对人们的生活产生较大威胁.哺乳动物体内排出的含氮废物主要为尿素.鸟类的排泄物中,含氮废物主要以尿酸的形式排出体外[2].嘌呤衍生物(PD,purine derivatives)包括尿囊素、尿酸、黄嘌呤和次黄嘌呤.在微生物的作用下,这些嘌呤衍生物均有可能实现互相转化.对于禽类粪便中大量存在的尿酸而言,除了在微生物的作用下分解为含氮无机物如氨气外,部分在微生物的分解作用下,可能会逐渐转换为尿囊素.其化学名称为N-(2,5-二氧代-4-咪唑啉啶基)尿素,分子式为C4H6N4O3.最早发现于动物的尿囊液中,能在热的水、醇和氢氧化钠溶液中溶解,常温下微溶,其水溶液呈弱酸性[3].尿囊素在医药领域、化妆品领域及农业领域均具有重要意义.

为探索鸡粪中尿酸分解细菌对尿酸的分解作用,为后期深入研究尿酸转化为尿囊素等含氮类化合物的生物转化作用机理奠定基础.本文通过初筛和复筛的方法分离具有尿酸降解作用的微生物,并对其鉴定,为进一步筛选具有尿囊素转化潜能的功能化微生物提供理论参考.

1 材料

1.1 样本

甘肃西和德青源种禽有限公司新鲜家禽粪便.

1.2 试剂

酵母膏提取物、牛肉膏提取物、蛋白胨、琼脂粉和葡萄糖等均购自碧云天试剂公司;尿酸购自国药试剂集团;细菌基因组提取试剂盒购自天根生化科技有限公司,琼脂糖购自厦门太阳马生物工程有限公司;所需其他分子生物学试剂均购自上海生工有限公司.

1.3 设备与仪器

BLY-200LH立式恒温摇床(上海丙林电子科技有限公司);HWS恒温培养箱(上海丙林电子科技有限公司);BKQ-B50II立式压力蒸汽灭菌器(爱来宝(医疗)医疗器械有限公司);离心机 5417R(Eppendorf);PCR仪9700(ABI);DYY-8C电泳仪(北京六一仪器厂);DK-24水浴锅(上海精宏实验设备有限公司);测序仪 3730XL(ABI).

1.4 培养基

培养基配方参照文献[4].筛选所用培养基按照功能分别为富集培养基、初筛培养基、复筛培养基和平板培养基.

富集培养基(g/L):尿酸10,酵母膏0.5,NaCl 0.5,MgSO40.5,KH2PO40.5,K2HPO42.0,pH 7.5,121℃ 高温高压灭菌;

初筛培养基(g/L):尿酸10,酵母膏 0.5,NaCl 0.5,MgSO40.5,K2HPO42.0,KH2PO40.5, 琼 脂 15,pH 7.5,121℃ 高温高压灭菌;

复筛培养基(g/L):尿酸 10,酵母膏 3,NaCl 0.1,MgSO40.5,K2HPO42.0,KH2PO40.5,pH 7.5,121℃高压灭菌;

平板培养基(g/L):尿酸10,酵母膏 3,NaCl 0.1,MgSO40.5,K2HPO42.0,KH2PO40.5,琼脂15,pH 7.5,121℃高压灭菌。

2 实验方法

2.1 菌株筛选

2.1.1 初筛

取100 mL三角瓶多个,称取干燥鸡粪2 g(10份),加入50 mL无菌生理盐水振荡混匀5 min,静置20 min.待瓶中上清液变清后,以无菌一次性吸管吸取1 mL接种至富集培养基中,并于25℃,130 r/min恒温振荡3 d,富集后的菌液按照梯度稀释后接种初筛培养基,25℃恒温培养 3 d后观察菌落形态及透明圈.以菌落周围出现白色透明圈作为标准,选取出现较为清晰透明圈的菌落纯化后保存备用.

2.1.2 复筛

将初筛菌株接种于 250 mL 发酵培养基中,25℃、130 r/min 恒温震荡培养24 h,从初筛菌株中筛选出具有对尿酸具有较高分解能力的菌株,保存备用.

2.1.3 目标菌株筛选

从复筛得到的菌株中选取一株出现频率较高的菌株保存用于后续研究.

2.2 形态学特征

取筛选保存后的细菌在平板培养基上通过划线法接种后,选取边缘清晰和形态规范的单菌落,将其接种至试管培养基中,于30℃条件下活化24 h长出菌膜后以接种环刮取少量菌膜,按常规方法涂片、干燥和固定.滴加结晶紫染色1～2 min后,倾去染色液,以水冲洗,然后滴加卢戈氏碘液媒染1 min,倾去碘液,水洗至流出水无色,最后以95%酒精脱色,之后复染,油镜下镜检观察.根据文献[5]的方法进行形态鉴定.

2.3 生理生化特征

生理生化特征的差异是与微生物活性相关的酶和蛋白质变化的外在体现,间接反映了微生物基因组之间的差异,但比基因组分析更直观和间接,可作为细菌鉴定的一种重要的辅助方法.为准确、快速及微量化鉴定该菌株,所有待测菌株的生理生化性质的测定参照文献[6]的方法进行.

2.4 菌株分子生物学鉴定

取 1.5 mL离心管,在加入200 μL 预处理液后放入玻璃珠,将适量菌样品放入研磨仪进行研磨.然后加入20 μL Proteinase K 溶液并混匀后于37℃放置50 min.后加入200 μL裂解液后混匀,于70℃放置10 min.再加200 μL无水乙醇颠倒混匀.过吸附柱,洗涤液洗1次,漂洗液洗2次后室温放置10 min,将残余的漂洗液晾干后转入一个新离心管,向吸附膜中间位置悬空滴加 50～100 μL ddH2O,室温放置5～10 min,12 000 r/min 离心 2 min,将溶液收集到离心管中.再使用通用引物27 F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG) 和1492 R (TACGGCTACCTTGTTACGACTT)筛选菌株 16S rRNA 基因进行扩增.扩增完成后,所得PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳验证后,送基因公司测序.测序完成后所得序列通过NCBI数据库进行BLAST比对,使用MEGA软件构建系统发育树.

3 结果与分析

3.1 10个尿酸转化菌16S rDNA序列分析鉴定结果

分别提取菌株DNA并以该菌株DNA为模板,通过细菌通用引物扩增细菌16S rDNA,得到长度为1375 bp的扩增产物(图 1),将测序结果在BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) 进行分析后以Mega 5进行系统发育树构建(图2).

图1 10株尿酸降解菌 16S rDNA电泳图(M为Marker)

图2 系统发育树构建

通过分子鉴定方法发现,随机挑选的对尿酸具有较强转化作用的10个单菌落主要分为Pseudomonaschlororaphissubsp.将Alcaligenesfaecalis、Providenciaburhodogranariea及Pseudomonaslini(表1).其中UA-2、UA-3、UA-4、UA-6、UA-9 和UA-10均为Alcaligenesfaecalis.其出现频率较高,占到60%.说明在鸡粪中,该菌为优势菌群.现以Alcaligenesfaecalis作为主要研究菌株.

表1 10株典型菌株的鉴定结果

3.2 Alcaligenes faecalis菌落形态

菌株经革兰氏染色后观察呈阴性,从图3(a)可知菌体为短杆状.由图3(b)可知在平板上添加尿酸后其表面看起来为白色,通过划线培养,发现该菌可将培养基中白色物质降解,菌落边缘整齐且光滑湿润不透明,形态为圆形,菌落呈淡黄色.

(a) Alcaligenes faecalis的革兰氏染色 (b) Alcaligenes faecalis对尿酸的降解作用

3.3 Alcaligenes faecalis生理生化特征

将筛选所得菌株接种于白色富含尿酸的固体培养基上观察菌落形态且完成革兰氏染色鉴定后,参照文献[5]和文献[6]对菌株进行葡萄糖发酵、吲哚试验、乳糖发酵、麦芽糖发酵、V-P 试验、蔗糖发酵、淀粉酶试验、氧化酶试验、硝酸盐还原、接触酶试验及亚硝酸盐还原等试验.这些特征符合Alcaligenesfaecalis的生理生化特征,见表2.

表2 Alcaligenes faecalis表型及生理生化特征

4 结论与讨论

微生物在分裂生殖过程中会释放出多种酶类,具有较好的生物转化能力.通过微生物实现化学物质的转化及合成研究日益增多.主要涉及药学领域、环境科学、化学及生态修复等领域.在药学领域,通过功能微生物菌株的生物转化作用,可实现多种药物结构的修饰,具有环保绿色及高效的特点.如皂苷类化合物属于天然药物中的一类重要成分.通过微生物转化技术,可实现羟基化、糖基化、羰基化和酯化等反应,进而提高其生物利用度和药理活性[7].在环境修复领域,多种细菌可通过生物吸附作用对镉等重金属离子实现无害化处理,且可以在较宽松的环境如pH值及温度范围内应用,不受气候条件影响[8].对于有机污染物的转化方面,细菌同样具有重要的分解作用.如邹桂香等[9]以微生物复合菌作用于人工配制的有机含氮废水.研究结果表明,上述复合菌在好氧条件和厌氧条件下均具有较好的分解能力.禽畜粪便中富含大量的含氮废物,如尿素、尿酸及硝酸盐类物质,它们在长期的堆积过程中,由于微生物的发酵分解作用,其中的含氮废物互相转化,部分以有毒气体的形式排放到大气中,对环境造成较大危害.从鸡粪中筛选具有较好分解功能的微生物菌株,通过扩大培养,定向筛选后,对部分物质如尿酸可实现转化作用,部分也会转化为具有较高利用价值的尿囊素等物质.

对于家禽养殖场而言,其粪便废弃物中富含大量尿酸.通过微生物实现结构及功能的转化,具有重要的生态和经济价值.本文通过富含尿酸的微生物筛选培养基,筛选对尿酸具有分解或转化作用的菌株,为后期的定向转化研究提供参考.研究从甘肃陇南西和县某养殖场采集的新鲜鸡粪中分离得到了四株具有尿酸分解能力的菌株.通过形态、生理生化及分子鉴定初步确定了四株细菌分别为Providenciaburhodogranariea(普罗维登斯菌)、Alcaligenesfaecalis(粪产碱菌)、Pseudomonaslini(亚麻假单胞菌)及Pseudomonaschlororaphissubsp.aurantiaca(绿针假单胞菌).其中,Providenciaburhodogranariea可实现多种物质的生物转化并具有一定的脱氮能力.普罗维登斯菌属微生物转化左旋多巴生产R-(+)-3-(3,4-二羟基苯基)-2-羟基丙酸,具体的微生物有产碱普罗威登斯菌、斯氏普罗威登斯菌、雷极普罗威登斯菌、害虫普罗威登斯菌、Providenciasneebia和Providenciaburhodogranariea[10].Alcaligenesfaecalis的研究报道较多,主要涉及其均有较好的硝化效率[11].另外还具有较高脲酶活性,可用于土壤重金属修复[12].对于其他一些有机污染物如苯酚-氰化物[13]、苯酚和喹啉[14]都具有较好的降解作用.李敏等[6]通过在养鸡场粪便中分离得到了Alcaligenesfaecalis,具有较好的硫化物转化能力.但对于尿酸的分解鲜有报道.另外两株细菌Pseudomonaslini(亚麻假单胞菌)及Pseudomonaschlororaphissubsp.Aurantiaca(绿针假单胞菌)在实验中具有一定的尿酸分解能力,但有关其他方面的研究报道较少.本文通过平板划线法可见所分离到的Alcaligenesfaecalis具有较好的尿酸降解活性,但是对其活性能力大小目前尚未见相关报道,本研究后期工作将继续深入研究该菌对尿酸的降解作用效率,进一步研究其活性酶的种类、功能以及其转化规律.