足三里穴位注射对胃溃疡大鼠Gsh-Px、EGF、Gas及Nrf2、GSTm1基因的影响*

张攀攀 林静瑜 周凡 许金森 程佑民

(1.福建中医药大学，福建 福州 3501082; 2.福建省中医药科学院，福建 福州 350003)

足三里是胃经合穴，胃之下合穴，临床上多用于治疗胃黏膜损伤性疾病。前期发现：足三里经预电针处理联合穴位注射生理盐水(NS)对吲哚美辛实验性胃溃疡大鼠胃黏膜具有保护作用，其机理与抗氧化有关[1]。非甾体抗炎药(NSAIDs)相关性胃病的发病涉及多个环节[2]，而针灸效应具有多途径、多靶点、整体调节的特点[3-4]，本文拟进一步探讨足三里对吲哚美辛实验性胃溃疡大鼠胃泌素(Gas)、表皮生长因子(EGF)的分泌、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力及Nrf2、GSTm1基因表达的影响，以期证实针刺效应机制的多途径、多靶点特点。

1 材料与方法

1.1动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量：200～220 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(浙江)2019-0002。

1.2主要试剂 吲哚美辛对照品(S18048-5g，纯度99%，源叶生物科技有限公司)；生理盐水(171009A44，福州海王福药制药有限公司)；谷胱甘肽过氧化物酶试剂盒(GSH-Px，A005-1-2，南京建成生物工程研究所)；大鼠胃泌素ELISA试剂盒(Gas，ml003029，mlbio)、大鼠表皮生长因子ELISA试剂盒(EGF，ml068740，mlbio)；异丙醇(20161203，国药集团化学试剂有限公司)；氯仿(20161102，国药集团化学试剂有限公司)；RNAiso Plus(9108，TaKaRa)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(RR047A，TaKaRa)；SYBR®Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus)(RR420A，TaKaRa)；Nrf2引物(序列F:GCTGCCATTAGTCAGTCGCTCTC，R：ACCGTGCCTTCAGTGTGCTTC；大小104bp)、GSTm1引物(序列F:TTCGTGCAGACAATTGTGGAGA,R:CTTGCCCAGGAACTCAGAGTAGA;大小149bp)，均由宝生物工程(大连)有限公司设计；HE染色试剂盒(G1120，Solarbio)。

1.3主要仪器 全功能酶标仪(Varioskan Flash，Therom)；石蜡切片机(RM2235，Lecia)；组织包埋机(YB-7LF，孝感亚光)；组织脱水机(ZT-14V2，孝感亚光)；脱色摇床(TS-92，其林贝尔)；恒温箱(DYY-6C，北京六一)；显微镜(DM18/DFC550，Lecia)；数显恒温电子水浴锅(HH-6，常州国华)；离心机(ST16R，Therom)；核酸检测仪(Nanodrop 2000，Thermo)；96孔热循环仪(Veriti，ABI)，Applied Biosystems Real-Time PCR System(ABI 7500 Fast，ABI)。

1.4实验方案

1.4.1分组 大鼠适应性饲养5 d后按随机数字法分为：正常组、模型组、足三里组，每组8只。

1.4.2预处理 分组结束后，对足三里组大鼠进行电针预处理。足三里定位、电针方法参照文献[5-6]：取双侧足三里穴电针(参数：疏密波、刺激频率为2 Hz/10 Hz)，20 min，1次/d，连续6 d；模型组大鼠于每日同时同等固定于鼠套20 min，1次/d，连续6 d，正常组不做任何处理。

1.4.3模型制备及干预 预处理结束，各组大鼠禁食不禁水18 h，于第7 d，模型组、足三里组大鼠腹腔注射吲哚美辛混悬液制备胃溃疡模型[7]，吲哚美辛注射60 min后，足三里组于双侧足三里穴注射NS 0.5 mL·kg-1，模型组同等抓取固定。

1.5取材 参照文献，于吲哚美辛注射后7 h取材[8-9]。各组大鼠腹腔注射10%水合氯醛3 mL·kg-1、腹主动脉采血，离心取血清，-80 ℃存；取胃，沿胃大弯剪开，冰生理盐水轻洗胃腔，冰上观察胃黏膜大体形态，按Guth[10]法计算胃黏膜损伤分数；剪取两黄豆大组织块，液氮冻存；剪取典型部位胃组织块1.0×1.0 cm2，置于4%多聚甲醛固定；剩余胃组织-80 ℃冻存。

1.6指标检测

1.6.1胃组织病理形态学 取固定24 h的胃组织、脱水、石蜡包埋、切片，脱蜡、苏木素染色、伊红染色，光镜下观察胃组织病理形态学变化。

1.6.2GSH-Px、EGF、GAS检测 根据按预试稀释比例，取胃组织加入适当比例冰生理盐水匀浆，3000 r·min-1离心，取上清，按南京建成试剂说明书检测胃组织GSH-Px活力；采用酶联免疫法(ELISA)建立标准曲线、检测、计算胃组织及血清EGF、GAS的含量。

1.6.3胃组织Nrf2、GSTm1 mRNA检测 取液氮冻存的胃组织块，放入液氮预冷的研钵中剪碎，研磨，加入1 mL RNAiso Plus抽提总RNA，按TaKaRa反转录试剂盒20 μL体系将总RNA反转录为cDNA，采用TaKaRa TB GreenTMPremix Ex TaqTM试剂盒两步法将cDNA 模板进行PCR扩增，每个样本基因及内参基因均设3个复孔，根据2-△△CT法对mRNA数据进行相对定量分析。

2 结果

2.1各组大鼠胃黏膜大体外观与胃溃疡指数比较 模型组大鼠胃黏膜损伤严重，黏膜表面弥散着点线状出血点，呈黑褐色，胃黏膜表面有黄白色黏液，去之可现凹点，胃黏膜变薄，皱襞减少，损伤分数高；足三里组大鼠胃黏膜的出血点、溃疡点较模型组明显减少，胃黏膜厚度、皱襞较接近正常，胃黏膜损伤分数较模型组低，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2各组大鼠胃黏膜病理形态 正常组大鼠的胃黏膜层完整，上皮细胞以及腺体排列整齐，结构完整，胃小凹清晰，未见明显充血、水肿以及炎性细胞浸润；模型组大鼠黏膜上皮细胞脱落、变性、缺损、见有明显的红细胞、炎性细胞浸润，损伤可达胃黏膜中、下层；足三里组大鼠胃黏膜上皮细胞脱落、变性、出血情况较模型组明显减轻，腺体排列较为整齐，损伤大部分局限在胃黏膜上层。见图1。

2.3各组大鼠GSH-Px活力、GAS、EGF含量比较 胃组织：与正常组比，模型组大鼠GSH-Px活力、EGF含量明显下降(P均<0.01)、Gas含量升高(P<0.05)；与模型组比，足三里组GSH-Px活力、EGF含量升高(P<0.05、P<0.01)，GAS含量明显下降(P<0.01)。与正常组比，足三里组EGF显著升高(P<0.01)，表明胃黏膜处于损伤修复活跃期。见表2，图2，图3。

血清：与正常组比，模型组EGF含量明显降低(P<0.01)、Gas含量明显升高(P<0.01)。与模型组比，足三里组EGF含量明显升高(P<0.01)、Gas水平显著下降(P<0.01)。见表3、图4。

2.4各组大鼠胃组织Nrf2、GSTm1基因表达情况Nrf2 mRNA：与正常组比，模型组Nrf2 mRNA表达量呈下降的趋势(P<0.2)、GSTm1 mRNA表达量明显减少(P<0.05)。与模型组比，足三里组Nrf2mRNA表达量呈上升的趋势(P=0.1)GSTm1mRNA表达量明显增加(P<0.05)，见表4，图5，Nrf2和GSTm1的溶解与扩增曲线见图6、图7。

3 讨论

针灸治未病涵盖了“未病先防”“既病防变”“瘥后防复”三方面，研究者认为针灸干预“以防为先”“以调为期”“介入时机宜早”等[11]。近年来，“针灸预处理”(古时称为“逆针灸”)的作用规律及机理研究逐渐兴起，研究表明，相较于病后针刺，“预针刺处理”不仅疗效较好，且可提前防治，减少医疗成本[12-14]。

非甾体抗炎药具有强大的解热、抗炎、镇痛作用，是临床上最常用的药物之一[15]。长期、大剂量地应用非甾体抗炎药，胃黏膜损害风险极高[16]。因此，对于NASIDs相关性胃病常采取防治结合的策略。针灸疗法治疗胃黏膜损伤性疾病疗效确切，可在不引入外源性药物的基础上，充分调动机体的内源性应激保护系统发挥防病治病作用。本研究采用“预电针处理”联合“穴位注射NS”的联合干预方案，旨在做到“未病先防”“既病防变”作用，提高足三里干预实验性胃溃疡的疗效。此外，预针刺处理也可避免大鼠经抓取、针刺等外界应激不适而产生的应激性胃损伤，影响疗效判定[17-18]。

胃黏膜长期暴露于各种损害因素下，自身通过一整套地防御机制抵御损伤并维持黏膜结构的完整性。GSH-Px是一种含硒抗氧化酶，GSH-Px水平的降低可加重氧自由基(ROS)和脂质过氧化对胃黏膜的损伤[19-20]。Gas由G细胞分泌，是促进胃酸分泌的主要激素，同时也是一种营养激素。适量的Gas可维持胃黏膜的完整性，过量的Gas则导致胃酸分泌过多，损伤胃黏膜。EGF是已被证实的胃黏膜保护因子之一，可促使溃疡周边正常上皮细胞移行覆盖至溃疡面以及进一步分裂、增殖、分化，维持胃黏膜上皮细胞的更新、促进损伤胃黏膜上皮的再生和腺体重建[21]。本研究结果显示：足三里经“电针预处理”联合“穴位注射NS”能够增强吲哚美辛胃溃疡大鼠GSH-Px活力，降低过高的GAS含量，并大幅提升EGF含量，表明针刺效应在抗氧化、抑酸、促进溃疡修复均起了积极的作用。

转录因子 NF-E2 相关因子(NF-E2-related factor 2，Nrf2)是体内抗氧化应激的关键信号分子，控制着谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白(TXN)抗氧化系统的关键成分以及Ⅰ相、Ⅱ相解毒酶的表达，并调节着多种ROS解毒酶的转录，在维持细胞氧化还原稳态方面发挥着重要作用[22]。谷胱甘肽S转移酶(GSTs)是Nrf2通路中下游的抗氧化和Ⅱ相解毒酶，其中，GSTm1可减少谷胱甘肽与内外源性疏水性亲电试剂的结合，参与前列腺素A2(PGA2)、前列腺素J2(PGJ2)与谷胱甘肽的结合等[23-25]。前文我们观察到，足三里保护吲哚美辛实验性胃溃疡的作用与提高血清SOD、GSH-Px活力、降低MDA水平及胃组织Nrf2的阳性表达有关[1]。在本文中，我们观察到足三里促进了吲哚美辛实验性胃溃疡胃组织Nrf2、GSTm1 基因的表达，进一步证明了足三里的胃黏膜保护作用与抗氧化有关。

综上所述，本研究结果表明足三里保护吲哚美辛实验性大鼠胃溃疡的作用与抗氧化、促进黏膜修复、减少胃酸分泌有关，其抗氧化作用可能与上调Nrf2、GSTm1基因的表达有关。针灸可能在“胃黏膜损伤与保护”的多个途径及靶点发挥整合作用，防治胃黏膜损伤。