热休克蛋白47与特发性肺纤维化关系研究进展

李雪恒 李龙

特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性进行性纤维性间质性肺炎，其特征是进行性肺瘢痕形成和常见间质性肺炎的组织学表现。确诊IPF主要依靠临床病史、体格检查、实验室检查、肺功能、胸部高分辨率CT和组织病理学的结合，并且排除其它病因的间质性肺病[1]。数据表明[2]，IPF诊断后的中位生存期约为2～3年，男性发病多于女性，常见于老年人，尤其是75岁以后的患病率和发病率更高。由于IPF是一种致命性疾病，目前可用的治疗方法疗效有限，因此早期的精确诊断非常重要。越来越多的研究发现[3-4]，热休克蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)与IPF有千丝万缕的联系，抑制HSP47的表达可以影响生物体内胶原蛋白的合成，进而抑制肺纤维化的进展。因此，本文就HSP47与IPF发病相关性的研究进展作一综述。

一、HSP47及其生物学功能

热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一类存在于所有生物界中的高度保守的蛋白质，按照分子量大小和彼此联系的密切程度，HSP又可分为：HSP110、HSP100、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40 和小HSP等家族。HSP能与很多蛋白质分子结合，在生物体内发挥多种生理功能，包括新生多肽链的正确折叠、变性蛋白质的重新折叠、蛋白质转运和天然蛋白质结构的稳定化等[5]。

HSP47是一种定位于内质网(endoplasmic reticulum，ER)的小分子量HSP，是各种胶原蛋白正确折叠和分泌所必需的重要伴侣，该蛋白最早在鸡胚成纤维细胞中被描述为一种能与I型胶原结合的HSP，后来通过对其核苷酸序列的测定，证实HSP47虽然缺乏丝氨酸蛋白酶抑制活性，但由SERPINH1基因编码,属于serpin家族[6]。在正常的生理情况下，生物体内均存在一定程度的HSP47表达，它广泛存在于体内能够表达胶原的细胞中，如纤维原细胞、平滑肌细胞等，参与前胶原的加工、折叠、聚合和分泌等过程，促进胶原的顺利合成。

HSP47作用的特异性底物是胶原，胶原是哺乳动物中含量最丰富的蛋白质，拥有特殊的三螺旋结构，由Gly-XY重复序列组成，HSP47 C末端具有ER滞留信号序列RDEL，专门识别胶原蛋白的三螺旋区域。HSP47与ER中的原胶原瞬时结合，以pH依赖性方式在顺式高尔基体或ER-高尔基体中间隔室中解离，然后通过其RDEL保留序列转运回ER[6-7]。另有实验发现[8]，HSP47还直接与富含亮氨酸的小蛋白家族核心蛋白聚糖、lumican和纤维调节蛋白相互作用，HSP47在核心蛋白聚糖存在下影响I型胶原原纤维的形成，特别是在原纤维生成的开始和结束时。

二、HSP47与IPF

1 HSP47与IPF发病关系

(1)HSP47在IPF胶原合成中的作用。IPF是一种胶原蛋白相关疾病，这种疾病的特征是胶原蛋白的异常积累和HSP47的表达增加。HSP47是一种胶原蛋白特异性分子伴侣，在ER中的胶原生物合成和原胶原的质量控制中起关键作用[9]。有研究发现[10]，在不存在HSP47的情况下，在正常培养温度下可以观察到胶原生物合成的各种缺陷,例如在ER中的积累、过度修饰包括脯氨酰羟基化、赖氨酰羟基化和进一步的糖基化，以及I型胶原同源三聚体的异常分泌，最终导致分泌的未折叠或错误折叠的对蛋白酶消化敏感的胶原蛋白的比例增加。而在IPF患者体内，HSP47高度表达，这导致胶原的正确合成和分泌增加，胶原异常积累，从而促进肺纤维化的发生[11]。

目前已有多项siRNA介导的HSP47敲低的实验所证实[12-14]，抑制HSP47表达可以抑制胶原蛋白的积累，从而抑制IPF的进展。例如，HSP47的选择性药理学抑制剂COL003可竞争性抑制HSP47与小鼠胚胎成纤维细胞中的前胶原蛋白之间的相互作用，减少胶原蛋白的分泌，从而抑制纤维化[3,14]。Takuto Miyamura等人[4]为了评估HSP47抑制剂对体外胶原合成和肺纤维化过程的影响而进行了一项实验，他们通过蛋白质印迹评估了胶原蛋白的表达，并分别通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑测定和划痕试验确定人和小鼠肺中的细胞活力和迁移成纤维细胞，最后发现，HSP47抑制剂以剂量依赖性方式降低转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)处理的肺成纤维细胞中I型胶原蛋白的表达，同时还降低了肺成纤维细胞的活力和细胞迁移能力。

(2)HSP47 与IPF相关细胞及细胞因子。IPF主要表现为弥漫性肺泡炎症、肺泡结构紊乱和肺纤维化形成，其特征是上皮损伤和异常组织修复，其中活化的效应细胞主要是成纤维细胞和肌成纤维细胞。实验发现[15]，HSP47影响成纤维细胞的胶原代谢，在HSP47高表达的成纤维细胞中，胶原蛋白的mRNA及蛋白质表达会显著增加，而在HSP47敲除的成纤维细胞的内质网中，胶原蛋白的分泌缓慢，最终被自噬降解，导致胶原合成减少。

HSP47的表达调控受各种细胞因子的影响，其中尤以转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)最为重要。TGF-β是成纤维细胞的关键激活剂，是纤维化反应的中心细胞效应器，也可能通过促进免疫和血管细胞中的纤维化表型发挥作用[16]。TGF-β有3个亚型，人体细胞中含量最高的是TGF-β1，它是参与肌成纤维细胞分化和促纤维化微环境创建的主要生长因子。已有研究证实[4，17-18]，体外TGF-β1可以诱导成纤维细胞、上皮细胞等多种细胞表达HSP47，也可以在转录水平调节HSP47的表达，是促进HSP47表达的主要细胞因子。有国外学者使用各种细胞因子处理成纤维细胞来诱导HSP47表达，最终发现[17]，在Th1细胞因子(IFN-γ和TNF-α)、Th2细胞因子(IL-4和IL-13)、促炎细胞因子(TGF-β1)、Th17细胞因子 (IL-17A)、Toll样受体配体和IL-1β等各种细胞因子中，只有TGF-β1显著增加HSP47水平，而且，TGF-β1可以以剂量依赖性方式同时增加HSP47mRNA和蛋白质表达。

在真核生物中，热休克反应受热休克转录因子(heat shock transcription factor，HSF)家族的调控，其中，HSF1主要负责调节哺乳动物细胞中的经典HSR[19]。有研究表明，HSP47的表达受HSF1的转录控制，在热休克时，HSF1与位于HSP47转录起始位点-180 bp的热休克元件结合，并激活HSP47 mRNA的转录，从而促进HSP47的表达。通过siRNA沉默HSF1可以阻止HSP47的诱导和随后的胶原蛋白生成，而HSF1的过表达则恢复了HSP47的表达水平以及胶原蛋白生成[20]。此外，也有研究发现，肺上皮中的HSR以及HSF1的激活会改变肺纤维化相关基因的表达，它们对IPF的发生发展有着一定的影响[21]。

(3)HSP47 与IPF相关信号通路。近年来发现，某些信号通路可以促进IPF的进展，这些信号通路可能和HSP47的致纤维化作用有关。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)家族是参与IPF的重要信号通路之一，可分为4个亚族：ERK、p38、JNK和ERK5。越来越多的证据证实，抑制MAPK信号通路可以抑制IPF的进展[22-23]。ERK1/2和JNK可以调节热休克转录因子，进而调节几乎所有HSP的合成[24]。由于HSP47是HSP家族的成员，因此有学者推测ERK1/2和JNK将参与HSP47的诱导表达，他们通过实验[25]首先证明TGF-β1处理HK-2细胞可激活ERK1/2和JNK通路，并且显著增加了HSP47的表达水平，随后使用ERK1/2和JNK MAPK抑制剂抑制ERK1/2和JNK信号，结果清楚地表明，体外诱导的HK-2细胞中HSP47表达水平也会随之降低，进而减少胶原蛋白表达以减轻纤维化程度。

(4)HSP47 与IPF相关基质金属蛋白酶。基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)是锌依赖性内切蛋白酶家族，可以降解细胞外基质的所有成分和许多非基质蛋白，因其在异常纤维化过程中的作用而被广泛研究。MMPs的表达及调控机制比较复杂，因此，其在诱导肺纤维化损伤中的具体作用尚未被研究透彻，一些MMPs的作用是促纤维化，而其它的则具有抗纤维化功能[26-27]。现有研究显示，HSP与MMPs之间有着密切联系，例如，HSP家族的一些成员是由MMP3诱导的，且MMP3和热休克因子1(HSF1)具有共调节作用，细胞内的MMP3和HSF1协同控制某些HSP基因的启动子区[28]。目前研究表明，HSP与MMPs在某些疾病的发生中相互关联[29-31]，例如，HSP可以通过与HSP27的界面位点AA29-40处的MMP-2和MMP-9直接相互作用促进胶质母细胞瘤肿瘤细胞中的上皮间质转化和细胞外基质重塑[29]。有学者在实验模型动物的进行性纤维化过程中观察到，HSP47的表达水平及MMP-2和MMP-9活性均增加，同时MMPs的组织抑制剂也增加，而且HSP47的表达水平更高，组织抑制剂的表达水平也更高[31]。

2 HSP47对于IPF的临床意义及药物治疗

在一项临床试验中[32]，研究人员以加重期IPF患者、稳定期IPF患者和健康者为研究对象，采用酶联免疫吸附试验测定各组血清HSP47水平，结果表明血清HSP47水平加重期患者高于稳定期患者，稳定期患者高于健康者。故而可以得出，IPF患者血清中HSP47水平随着病情的加重而升高，检测血清HSP47水平有利于辅助评估IPF患者的病情严重程度。

尽管IPF发病率逐年增加，但目前尚无能够治愈IPF的药物。某些学者通过研究发现[33]，HSP47的功能障碍可以通过两种伴随方式减轻纤维化：抑制胶原蛋白分泌和诱导胶原蛋白产生细胞凋亡。因此，HSP47的下调或HSP47功能的化学抑制代表了一种治疗各种纤维化的新治疗策略。

吡非尼酮是一种新型抗纤维化、抗炎和抗氧化化合物，在多个关于吡非尼酮的临床试验中，与安慰剂相比，吡非尼酮可有效减慢IPF患者的疾病进展[34-35]。另有多项研究发现[36-37]，吡非尼酮抗纤维化作用不仅可能通过直接抑制I型胶原蛋白表达介导，还可能通过抑制肺泡上皮细胞中HSP47表达介导，导致胶原蛋白合成减少，从而抑制纤维化疾病的进展。

从某些中药中提取到的一些物质也能通过抑制HSP47而达到抗肺纤维化的作用。青蒿琥酯是青蒿素的水溶性半琥珀酸盐衍生物，具有抗炎、抗肿瘤和免疫调节等多种药理活性[38]。研究发现，青蒿琥酯能够减少人胚肺成纤维细胞胶原的产生，另有研究人员通过复制大鼠肺纤维化模型，观察到使用青蒿琥酯干预能够显著降低HSP47水平，这与胶原的变化趋势相同[39]。大黄素，一种从大黄中提取的主要生物活性蒽醌衍生物，被认为具有多种药理作用，包括抗炎、免疫调节、抗纤维化、抗肿瘤、抗病毒、抗菌等[40]。GuanRuijuan等人进行的大鼠实验结果证实，大黄素可以通过抑制TGF-β1信号传导来抑制HSP47表达以及细胞外基质沉积，显著缓解大鼠的肺水肿和肺纤维化程度，发挥其抗肺纤维化作用[41]。

某研究[12]测试了ND-L02-s0201在临床前肺纤维化模型中的功效，ND-L02-s0201是一种脂质纳米颗粒，包裹了一种siRNA，可抑制HSP47的表达。在博来霉素诱导的大鼠肺纤维化模型中，他们证明了ND-L02-s0201治疗后相对肺重量、胶原沉积和组织学以及纤维化评分的剂量依赖性和统计学显著降低。同时在二氧化硅诱导的大鼠肺纤维化模型中也观察到了ND-L02-s0201的抗纤维化作用，ND-L02-s0201的干预导致小鼠肺组织病理学改变的改善并阻止了纤维化的恶化。最后可以得出结论，ND-L02-s0201逆转肺间质纤维化，恢复肺的结构完整性，并改善临床前大鼠模型的肺功能。因此，体内HSP47表达水平和IPF的发生有一定的相关性，抑制HSP47的表达可以抑制肺纤维化的进展，甚至可能逆转肺纤维化。

总体而言，这些研究可以证明HSP47是IPF的潜在治疗靶点，HSP47可能通过抑制胶原蛋白的过度表达来介导抗纤维化作用，这些均可以为设计更有效的治疗肺纤维化的药物提供一定基础。

三、小 结

IPF是一种慢性进展性肺部疾病，通常无法逆转，总体预后较差，而且目前可用的治疗方法疗效有限。越来越多的证据表明,HSP47可以作为未来潜在治疗IPF的靶点，抑制HSP47的小化合物将是治疗肺纤维化的有希望的候选者，有望为IPF提供新的治疗方向和思路，因此，我们仍需更加深入地探索以其为靶点的肺纤维化发病机制及其表达调控，同时HSP47与IPF发病相关物质之间具体相互作用机制也需要进一步的研究。本文总结了HSP47与IPF发病相关的研究成果，并阐述了HSP47的临床意义，旨在指导临床治疗。