心肌梗死相关miRNA-mRNA调控网络及其作用

王雯雯，延伟伟，莫霄云

1 广西中医药大学第一临床医学院，南宁 530299；2 广西中医药大学第一附属医院心血管内科

随着人们生活方式的改变，心血管疾病的发生率和病死率不断上升，目前心血管疾病在我国所有疾病中的病死率高居首位［1］。心肌梗死（MI）是指冠状动脉发生的一种心肌缺血性坏死疾病，且MI能够诱发心源性休克、心房颤动、心力衰竭等［2］，严重威胁患者的健康。目前临床对于MI 的治疗仍以药物治疗及手术治疗为主，但随着对MI发病机制深入研究发现，通过抗血小板聚集、再灌注治疗及溶栓、取栓、血管重建术等改善心肌缺血及心室重构，可有效缓解疾病的进展［3］。尽管如此，MI 的病死率仍不断上升［4］，预计到2030 年我国将有3 000 万MI 患者［1］。生物信息学通过对生物医药领域的信息进行收集、处理以及利用，进而从基因分子层面揭示疾病的发生机制及潜在规律。因此，本研究通过生物信息学对MI 中差异表达微小RNA（miRNA）和差异表达基因进行分析，并建立MI 的miRNA-mRNA 调控网络，为MI的治疗及其预防提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 MI患者miRNA数据集的选取 选择基因表达数据库（GEO， https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds），检索该数据库2021年12月—2022年9月的数据，以“miocardial infarction”“miRNA”等为关键词，通过勾选Homo sapiens（智人）种属和Non-coding RNA profiling by array 研究类型，共检索到234 篇有关MI 的文献；根据其是否具有样本独立性、组间可比性、样本类型等标准最终筛选得到GSE61741 基因表达谱，包含外周血样本（MI患者样本62例、正常人样本94 例）的miRNA 微阵列数据集，该平台芯片为GPL9040（febit Homo Sapiens miRBase13.0）。本研究以62 例MI 疾病样本作为MI 疾病组，62 例正常人样本作为正常组。

1.2 差异表达miRNA 的筛选 用Perl 软件对miRNA 基因表达谱原始数据集进行基因重注释，并用R语言对其进行校正、分类，用limma包对miRNA数据进行差异分析，筛选标准设置为：P＜0.05，|logFC|＞1。用pheatmap 包根据筛选出来的差异miRNA 绘制热图和火山图。

1.3 差异表达miRNA 下游靶基因预测 用miRNet（https：//www.mirnet.ca/miRNet/upload/MirUpload-View. xhtml）在线网站分析miRNA-mRNA 的相互作用关系，对差异表达的miRNA 下游靶基因进行预测。

1.4 差异表达miRNA 上游结合转录因子预测 采用FunRich3.1.3 分析基因和蛋白质功能富集、相互作用网络，预测在MI患者外周血中存在目标靶基因的差异表达miRNA 上游结合转录因子，在该软件内分别输入所获取的差异表达miRNA，并取排名前10且具有意义的转录结合因子。

1.5 差异表达基因数据处理 采用GEO 数据库获取mRNA 数据集并对差异表达miRNA 的可靠性及其预测下游靶基因的真实性进行验证。在GEO 数据库中检索“miocardial infarction”“mRNA”等关键词，最终由GPL570 平台｛［HG-U133_Plus_2］ Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array｝分析GSE66360 数据集。利用Perl 对mRNA 数据集进行基因重注释，并利用R语言校正、分类，筛选标准：P＜0.05，|logFC|＞1。用limma 包对mRNA 数据集中的50 个正常组及49 个MI 疾病组进行差异分析，制作火山图。

1.6 差异表达miRNA 下游目标基因的筛选 利用GEO 数据库明确上述获得的MI 疾病组与正常组样本间的上、下调表达mRNA，并将上调表达miRNA与下调表达mRNA 取交集；将下调表达miRNA 与上调差异mRNA 取交集，从而得到差异表达miRNA 下游目标基因，最后绘制韦恩图。

1.7 基因本体（GO）生物学功能注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析 使用enrichplot包、clusterProfiler 包及DOSE 包，通过R 语言对MI 中差异表达miRNA 下游目标基因进行GO 生物学功能注释及KEGG通路富集分析，其中GO包括生物学过程（BP）、细胞组分（CC）、分子功能（MF）。

1.8 蛋白质相互作用（PPI）网络的构建及关键基因鉴定 采用String 数据库，综合得分≥0.4 的条件下构建PPI网络。运用cytoscape3.9.1软件的插件“cytohubba”进行网络拓扑分析，并利用Degree 度、边过滤成分、最大邻居组件、BottleNeck 等四种不同算法分别筛选出PPI 网络中排名前10 的关键基因，将不同算法的前10名基因取交集获得Hub基因。

1.9 Hub 基因及关键miRNA 的预测 采用miRNet在线数据库，将所获取的Hub 基因导入即获得相应miRNA，通过可视化呈现Hub 基因及相应miRNA 的网络调控图，通过综合分析筛选出与Hub 基因相关性排名前5的miRNA。

2 结果

2.1 芯片数据集中的差异表达miRNA 共得到162 个差异表达miRNA，其中表达上调基因93 个、表达下调基因69个。

2.2 差异表达miRNA 的下游靶基因 得到在外周血中存在下游靶基因的17 个差异表达miRNA。其中4 个表达上调miRNA，分别为miR-19b-3p、miR-132-5p、miR-223-3p、miR-223；13 个表达下调miRNA，分 别 为miR-155-5p、miR-20a-5p、miR-21-5p、miR-455-3p、miR-33a-5p、miR-20a-3p、miR-33a-3p、miR-33b-3p、miR-155-3p、miR-21、miR-155、miR-20a、miR-33a。在miRNet 数据库中，表达上、下调miRNA 各自含有2 105、7 991个对应的下游靶基因。表达上、下调miRNA-靶基因的调控网络。

2.3 差异表达miRNA 的上游结合转录因子 通过FunRich（http：//www. funrich. org/）在线预测17 个差异表达miRNA 在外周血中的上游结合转录因子，取评分最高的前10 个转录因子。差异表达miRNA中4个表达上调基因的前10个转录因子分别为配对盒 基 因6（PAX6）、2 级POU 结 构 域 转 录 因 子1（POU2F1）、核受体亚家族6A 组成员1（NR6A1）、特异性蛋白1（SP1）、同源框A9（HOXA9）、前B 细胞白血病转录因子1（PBX1）、同源盒基因A13（HOXA13）、肌细胞增强因子2A（MEF2A）、胚胎外组织精子发生同源盒基因1（ESX1）、同源盒基因B13（HOXB13），其中PAX6、POU2F1、NR6A1、SP1 差异表达有统计学意义（P均＜0.05）。差异表达miRNA中13 个表达下调基因前10 个转录因子分别为SP4、早期生长反应因子1（EGR1）、POU2F1、SP1、SOX1、MEF2A、FOXA1、ras 反应元件结合蛋白1（RREB1）、FOXO1、HOXA3，差异表达均有统计学意义（P均＜0.05）。由于POU2F1、SP1 转录因子均与表达上、下调基因存在调控关系，故POU2F1、SP1 在此最为重要。

2.4 MI 差异表达基因 获得289 个上调和62 个下调显著差异表达mRNA。使用维恩图对差异表达mRNA 及差异表达miRNA 所预测的下游靶基因取交集，可获得表达上调miRNA 的靶向目标基因2个，下调的靶向目标基因163个。

2.5 GO 和KEGG 富集分析结果 GO 富集分析发现，目标基因的生物学过程主要与细菌来源分子的反应、对脂多糖的反应、细胞因子产生的正调节等相关；在细胞组分中主要富集在三级颗粒、富含纤胶凝蛋白1颗粒体、分泌颗粒腔等；在分子功能中主要富集在细胞因子活性、趋化因子活性、DNA 结合转录激活活性、RNA 聚合酶Ⅱ特异性等。KEGG 富集分析发现，目标基因主要在TNF 信号通路、IL-17 信号通路、NF-κB信号通路中显著富集。

2.6 构建PPI网络及Hub 基因的筛选 获得居前7位Hub 基因：FOS、纤维连接蛋白1（FN1）、JUN、NFKBIA、肿瘤坏死因子（TNF）、趋化因子CXC 基序配体8（CXCL8）、IL-1β。

2.7 7 个Hub 基因与相关miRNA 的预测 通过综合评价筛选出排名前5 的核心miRNA，分别为miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-129-2-3p、miR-24-3p。

3 讨论

miRNA 作为表观遗传学的一种方式，在基因表达调控中起关键作用，但绝大多数miRNA-mRNA之间的相互作用并未完全阐明［5］。有研究发现，miRNA 能够通过负向调控mRNA 的表达，进而降低因缺氧而导致的心肌细胞损伤，认为miRNA 可以作为诊断MI 的生物标志物［6］。但是，未进一步探究与MI 中的miRNA 分子机制，且MI 疾病发展过程中参与miRNA 介导的调控机制的分子网络也尚未明确。因此，本研究从生物分子学角度出发，利用生物信息学挖掘出与MI 相关的调控基因及其相关miRNA，明确其分子机制，为防治MI 提供一定的理论依据。

在本研究中，通过分析miRNA 基因芯片数据集的差异表达情况，进而得到17 个具有异常表达的miRNA，其中表达上调miRNA 有4 个，表达下调miRNA 有13 个。miR-19b-3p 作为早期诊断MI 的重要指标，其在MI 患者血浆中处于高表达状态［7］；MI患者血浆中miR-223-3p 的水平较健康人群明显上升［8］；此外，miR-223 在MI 患者的血清中也存在高表达，其高表达可加速心肌细胞的凋亡［9］。研究表明，MI 患者血清中miR-21 的表达上升，能够诱发心肌梗死的发生［10］；另有研究发现，miR-155-5p 表达下调可通过Cab39 /AMPK 信号通路，延缓人类间充质干细胞衰老，进而起到预防MI 的作用［11］。这与本研究结果有差异，可能由于标本采集的组织、部位及实验室所选择的方法不同造成的，仍需进一步探究。

miRNA 与结合转录因子之间可发生相互作用，miRNA 的表达受相关结合转录因子的支配，其也可以反作用于转录因子，二者联合可调控下游mRNA的转录及翻译，是细胞代谢的重要调节剂［12］。为此本研究通过预测差异表达miRNA 的相关结合转录因子，发现SP1作为转录因子，能够参与生物细胞的生长分化、增殖、凋亡等基本生物学过程，其在调节心肌细胞生长凋亡及防治MI的作用得到了证实［13］。POU2F1 也被称为八聚体结合转录因子1，是一种位于1q24 染色体上的重要转录因子；有研究发现当小鼠MI 组织中的POU2F1 高表达时，可促进心肌成纤维细胞分化，进而加重细胞外基质的硬度，导致MI发生［14］。EGR1 作为一种重要的转录因子，其在诱导细胞凋亡、调节细胞炎症和干预心肌细胞纤维化中起到了关键作用；当EGR1 表达下调时，可降低心肌细胞中的炎症因子的产生和细胞纤维化，因此下调EGR1 表达可能是治疗MI 及其并发症的一种防治手段［15］。

本研究通过对差异表达miRNA 及其下游差异表达mRNA 进行整合，得到miRNA 表达上调靶向目标基因2个和表达下调靶向目标基因163个。经GO功能注释及KEGG 富集分析发现165 个目标基因主要富集在细菌来源分子的反应、三级颗粒、细胞因子活性等相关生物功能以及聚集在TNF、IL-17、NF-κB等信号通路中。TNF-α作为炎症反应的重要调节因子，其诱导的信号通路在细胞对炎症和损伤的反应中扮演了重要角色；炎症免疫反应是MI 的诱因之一，而激活的TNF-α信号通路可以改善血管循环、缓解冠状动脉硬化、修复心肌损伤和心脏重构，进而对MI 起到防治作用［16］。IL-17 是一种能够以血管作为靶目标的炎症细胞因子，其不仅可与相同细胞因子结合增加血小板聚集，增加血栓形成风险；而且可通过募集白细胞和活化内皮细胞，进而诱导心肌胞凋亡，加重心肌缺血和再灌注损伤程度，最后加快MI的发展进程［17］。心肌细胞的氧化应激反应及凋亡是MI发病后出现的病理变化，其严重程度可判断MI的进展［6，18］。NF-κB 是一种具有多种转录功能的蛋白，其参与多种细胞活动；有研究发现，TLR4/NF-κB 信号通路在介导MI 的炎症反应及细胞凋亡中发挥了关键作用，TLR4/NF-κB在MI心肌组织中呈高表达，当其信号通路激活时可加重心肌损伤；而使用氧化物酶2（Prdx2）蛋白抑制TLR4/NF-κB 信号通路时可降低心肌细胞的氧化应激和凋亡水平，起到治疗MI的作用［18］。因此上述不同途径均可成为MI 治疗的潜在机制。

本研究进一步通过构建miRNA-mRNA 调控网络，利用网络拓扑分析，采用四种不同算法筛选出前10位目标基因，并取交集进而获得7个Hub基因，分别为JUN、FOS、TNF。CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β。CXCL8 作为趋化因子家族中的一员，在心脏损伤、修复和重塑中起到关键介导作用，可通过募集白细胞及控制中心粒细胞浸润进而减缓MI 所引发的炎症反应［19］；FN1 参与了MI 诱导的心肌纤维化和炎症反应，其在MI 患者的心肌组织中呈高表达，当使用FNI 拮抗剂剂后可有效改善MI 所导致的心肌细胞凋亡、炎症及氧化应激反应［20］；NFKBIA 是NF-κB 的抑制剂，通过抑制NF-κB 信号通路激活，降低NF-κB在MI中的促炎作用，进而保护心肌［21］；IL-1β 是一种炎症因子，在心血管疾病发生中起关键作用，MI 患者中使用IL-1β 抑制剂后，心血管不良事件发生率降低［22］。由此可见，CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 参与MI 的发生发展过程，但目前尚未发现JUN、FOS、MI的相关文献报道。

为进一步验证MI 相关miRNA，根据筛出的7 个Hub 基因利用miRNet 在线数据库对其有关miRNA进行预测，并取前5 位miRNA。目前对于miRNA 的相关研究与日俱增，但miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 与MI 的报道并不多见。有研究发现，心肌缺血引起的缺氧是导致MI的重要原因，而miR-34a-5p过度表达会加重心肌缺氧的发生；通过构建缺氧MI 细胞模型，发现抑制miR-34a-5p表达可以保护心肌细胞免受缺氧损伤［23］。miRNA（包括miR-24-3p）在MI 中不同的表达及其对下游靶基因的作用影响着MI 的发生。有研究表明，miR-24-3p 在心肌缺血/再灌注中表达上调，其下游靶基因RIPK1 表达上调；RIPK1 高表达可增加心肌梗死面积，加速细胞凋亡，而miR-24-3p 可通过抑制RIPK1 表达进而保护受损心肌细胞［24］。此外亦有研究发现，miR-130a-3p 具有类似的调控效果，上调miR-130a-3p表达可抑制过度的心肌母细胞自噬并改善心肌缺血/再灌注损伤［25］。miR-129-2-3p在MI 中的调控作用经查阅相关文献后并未见相关报道。

综上所述，本研究成功构建了MI 相关的miRNA-mRNA 调控网络，发现CXCL8、FN1、NFKBIA、IL-1β、TNF 及其所对应的miR-34a-5p、miR-155-5p、miR-130a-3p、miR-24-3p 在MI 发生发展及其防治过程中发挥调控作用。本研究仍存在不足，如所筛选的基因芯片样本数量不够多，只进行了理论层面的分析，而未对MI调控网络的体内外实验进行验证。