心肌细胞中早期内涵体的作用研究进展

祖丽皮亚·阿不力海提，曾江正

1 海南医学院第一临床学院，海口 570102；2 海南医学院第一附属医院肿瘤内科

内涵体是膜运输过程中的重要细胞器，根据其形态结构和功能分为三种类型，即早期内涵体（EE）、晚期内涵体（LE）和分选内涵体（SE）［1-2］。EE是接受从细胞质膜内吞转入物质的第一个内吞区室，而且是一个高度活跃的结构，具有很高的同型融合倾向［3］。EE 的主要作用是根据内吞物质的去向而对内吞物质进行分类，决定这些物质重新回到质膜中还是进入溶酶体中被进一步降解或传递至反式高尔基网络中［4］。SE是内吞物质进行细胞内循环的膜室结构，通过“快速”回收途径和“慢速”回收途径将内吞物质再次回收到细胞质膜中。在“快速”回收途径中，SE 将内吞物质直接从EE 上回收至细胞质膜中，然而在“慢速”回收途径中，膜小管先将物质运送到核周的内吞循环室（ERC）［5］。ERC 后续会产生流向细胞质膜的循环内涵体，从而将物质回收至细胞质膜中。这两种途径都是SE 维持细胞内物质循环的作用机制。如果内涵体的形态结构或功能发生异常，都能够影响细胞正常功能，导致机体出现相关疾病。心肌细胞的代谢非常旺盛，其功能由各种受体和体液调节。因此心肌细胞中的内涵体，尤其是EE 的功能非常重要。本文对EE 在心肌细胞中的作用，尤其是近年来的研究进展进行概述。

1 EE的结构和成熟过程

1.1 结构 EE是由于细胞内吞作用形成含有内吞物质膜结合的细胞器，在大多数细胞中，EE表现为一个精细且复杂的多形性区室结构，由薄管状延伸物（直径约为60 nm）和大囊泡（直径约为400 nm）组成，具有膜内陷且能形成多囊状外观的特点［6］。EE表面具有特定的蛋白质和脂质成分，二者作为EE表面标志物，在细胞内吞过程中发挥重要作用。

EE中的重要蛋白质包括以下几种。①Ras相关结合蛋白（Rab）：也称为小GTP结合蛋白，其中Rab5是EE最具代表性的表面标志物，它参与物质从质膜到EE 的运输过程［1，6］。②人VPS34/p150 磷脂酰肌醇3 激酶复合物：是Rab5 效应蛋白之一，其最主要的作用是产生磷脂酰肌醇［PtdIns（3）P］，PtdIns（3）P为EE 中最丰富的磷酸肌醇［1-2］。③EE 抗 原-1（EEA1）：是Rab5 效应蛋白，主要作用是调节EE 融合过程［1，5］。④可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子受体附着蛋白受体：它是一类高度保守的膜蛋白，可调节膜运输中的融合过程。⑤C-末端Eps15 同源结构域蛋白（EHD）：哺乳动物细胞中的EHD 主要包括EHD1～4 四种类型，既可调节受体的回收过程，又可在EE 运输中与Rab5、Rab4 协同发挥作用。⑥EE 中的动力蛋白：如动力蛋白-动力蛋白激活蛋白复合物，它是参与EE 囊泡运动的运动蛋白复合物之一［1-2］。

除此之外，EE 中的脂质PtdIns（3）P 通过招募含有特定结构域的蛋白质，在膜转运途径中发挥关键作用［1］。

1.2 成熟过程 EE 在形态、定位、组成、功能等方面具有明显的异质性，而且具备很强的同型和异型融合的能力［2］。内涵体膜上的GTP 酶从Rab5 到Rab7的转换标志着EE逐渐成熟为LE。值得注意的是，Rab7 是典型的LE 标志物。内涵体中Rab5 的丢失与Rab7 的获取同时发生的这一过程被称为“Rab转换”。研究表明，Rab 转换是细胞外环境中的物质从EE传递至LE的机制。内涵体中所有的分子活动都具有严密且精准的调控机制，EE的成熟过程也不例外。EE 向LE 的转变是在复杂的正反馈环路调控下进行的。首先，Rab5 被Rabex5 募集到内涵体上，Rabex5 是Rab5 特异性的鸟嘌呤交换因子。随后，Rab5效应因子Rabaptin-5进一步促进鸟嘌呤交换因子的活动，整个过程为Rab5的激活提供了一个正反馈环路［4］。SAND-1/Mon1 是EE 成熟为LE 过程（也称为Rab 转换）的转换开关，可以调控Rab5 和Rab7的活性状态。在这一过程中，SAND-1/Mon1 通过取代EE 膜上的Rabex5 而作为正反馈环路的干扰物，而且，它也通过与Rab7 的鸟嘌呤交换因子HOPS 复合物相互作用来积极推动Rab7 在内涵体上的募集过程。除此之外，内涵体成熟的另外一种机制是磷酸肌醇转换（PI conversion），这里的PI指PtdIns（3）P、PtdIns（3，5）P（2），它们是鉴别EE 和LE 膜的两种不可或缺的脂质［2］。二者可以招募许多具有PI结合域的效应蛋白，包括FYVE、PH、PX、GRAM，从而实现PI转换。换句话说，PI转换本质上是通过PIKfyve的募集来实现PtdIns-3-P到PtdIns-3，5-P的转换。除了内涵体形态结构的变化，作为内吞细胞器，内涵体腔内环境pH 的改变也是内涵体成熟的必然条件。EE的pH 6.1～6.8，LE的pH 4.8～6.0，而溶酶体的pH则可降至大约4.5［4，7］。由此可见，内涵体的成熟必须经过酸化这一重要的腔内变化。酸化是由液泡型H+ATP酶调控，它们是大型复杂的质子泵，由膜相关的V0 复合体（可充当质子的跨膜孔）和可溶性的胞质V1复合体（可结合并水解ATP）构成。管腔pH 值的调节包括V-ATPase浓度的调节、V-ATPase亚型的选择以及V0 和V1 复合物的结合、解离等［7］。在此过程中，越来越多的H+进入EE 管腔，引起pH 下降，导致EE向LE形态变化的发生。

2 EE的作用及相关疾病

2.1 作用

2.1.1 分选作用 如上所述，EE 是通过内吞途径对物质（如受体和脂质等）进行分类的关键站点，这正是EE 首要且最有价值的功能［1］。物质被EE 吸收后分类到各种内吞途径中，包括被回收到细胞质膜中、在溶酶体中降解或运送至反式高尔基体网络（trans-Golgi 网）中［8］。EE 参与膜转运介导的营养吸收、免疫、细胞迁移、黏附和细胞分裂等基本过程。因此，EE的分选作用对哺乳动物细胞维持正常功能至关重要［5］。

2.1.2 在细胞中的多种作用 EE 是信号通路中的调控连接器［9］，EE 的运动在细胞中具有多种作用。EE 可以将致病因子从感染的菌丝顶端转移到细胞核。而且，EE的运动在信号正确解码过程中的作用不可忽视［10］。N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）激活的ERK/MAPK 信号通路也是由EE 分选调控。NMDAR信号通路异常与几种癌症相关，如阻断NMDAR 受体可对乳腺癌细胞株中EE 的功能产生显著作用，这表明异常的谷氨酸信号通路可能通过内吞动力学的失调促进了癌的发生［9］。因此，纠正NMDAR 依赖性膜转运过程中的缺陷可能为癌症治疗提供潜在的研究方向。

2.1.3 在细胞自噬中的作用 自噬是在正常和应激条件下维持细胞内稳态的细胞内降解途径。EE参与自噬囊泡或降解性自噬囊泡的形成［11］。内涵体中的一些蛋白质，如Rab 蛋白（Rab11、Rab33b、Rab5、Rab7）及EEA1都可影响自噬过程［12］。细胞内吞和自噬之间存在着相互作用［13］。因此，Rab 蛋白既可调节细胞内吞又参与自噬过程，从而能够控制细胞内环境的稳态。因此，EE是内吞和自噬通路调节细胞稳态所必需的。

2.2 相关疾病 蛋白质、脂质等大分子物质与EE联系途径中的缺陷干扰了EE 的成熟过程和功能。EE 成熟过程中Rab5-Rab7“转换开关”的破坏可能是导致EE 肿大的机制之一，而EE 的异常肿大或数量增多是多种疾病的发病机制［2］。研究表明，在阿尔茨海默病的早期阶段，许多神经元的Aβ 肽水平升高，并且Rab5 阳性的EE 增大［14］。类似的内吞缺陷也见于唐氏综合征、尼曼-皮克病C型和老年性黄斑变性。Rab5 内涵体运动能力的降低导致亨廷顿病患者的神经退行性变。EEA1 的表达恢复了MECP2 缺失神经元的稳态突触可塑性，为干预Rett综合征提供了新的靶点［15］。而且，研究发现，在帕金森病和HIV-1 Tat神经毒性中均存在内涵体-溶酶体系统功能障碍［14］。

3 EE在心肌细胞中的作用

3.1 EE 在心脏电生理中的作用 正常的心脏功能依赖于膜离子通道、转运体、泵、激素受体的协同活动来动态调节膜电化学梯度以应对急性和慢性应激［16］。在膜蛋白的表达和定位过程中，内涵体系统是主要的调节因子，同时它也调节心脏的兴奋性。EHD3 是EE 的标志物之一，是心脏内蛋白质转运的重要组成部分，通过调节心室内Na+/Ca2+交换器（NCX）和电压门控L型Ca2+通道的顺行转运，维持心脏兴奋性［16］。EHD3 在心脏膜蛋白运输和正常生理中起关键作用，并与心脏疾病的发生密切相关。EHD3 缺乏的小鼠表现出心动过缓、心率下降、Ⅱ型传导阻滞和对β2-肾上腺素受体刺激的迟钝反应，在保持心输出量不变的情况下，EHD3 缺乏小鼠的心脏显著增大。此外，EHD3 与细胞骨架膜适配蛋白（AnkB）之间存在直接的蛋白/蛋白相互作用。AnkB 和EHD3 功能丧失可导致心脏功能严重受损，最终导致患者出现心室颤动、心房颤动、窦房结疾病、房室传导阻滞、心源性猝死等［17］。EE 的其他标志物也参与离子通道的转运。如Rab5 是快速内吞电压门控K+通道（Kv通道）的主要效应体，这对心肌细胞的动作电位复极至关重要。Rab4 参与Kv1.5通道的内化后转运［18］。此外，在心脏兴奋收缩耦联过程中，心室肌的动作电位触发单个肌细胞中电压依 赖 性 的L 型Ca2+（CaV1.2）通 道 短 暂 打 开［23］。CaV1.2 通道的三种内涵体宿主分别位于Rab4 阳性的EE、Rab11 阳性的循环内涵体和Rab7 阳性的LE/溶酶体［19］。CaV1.2 通道在心肌细胞肌膜上的表达受EE 及其蛋白标志物特别是Rab 蛋白的严格控制和调控，并不断被EE 内化、分类、循环。而且，在应对急性缺氧和缺血时，心脏NaV1.5 通道中有促心律失常的晚期钠电流通过，被称为缺氧诱导晚期电流。心肌缺氧可引起Na+内流增加、细胞内Na+浓度升高以及膜电位去极化，这是导致致命性心律失常的常见机制［20］。因此认为EE 是调节离子通道交换的关键细胞器。探索EE 在离子通道转运中的作用及其调控机制对维持正常心脏功能、深入了解心脏疾病的发病机制具有重要意义。

3.2 EE 在心脏疾病诊断中的作用 EE 起源于外泌体，而外泌体在急性心肌梗死（AMI）中具有很强的信息传递潜能［21］，并且已被用作诊断癌症的生物标志物。EE 通过内涵体膜向内出芽形成腔内囊泡（ILV），也称为外泌体前体。ILV 与质膜融合，释放ILV 到细胞外空间（外泌体）［22］，这一过程以依赖于运输所需的内涵体分选复合体（ESCRT）或不依赖于ESCRT 的方式进行。外泌体也可将具有生物活性的RNA 分子转移到靶细胞。在AMI中，与心肌肌钙蛋白相比，可以更早在血液中检测到心肌特异性miRNA（心肌梗死后＜4 h），外泌体可为诊断或预测缺氧缺血性疾病的潜在生物标志物［23］。由于来自EE 的外泌体在心脏疾病中有重要作用，因此EE 可能成为心脏疾病诊断的标志物之一。但目前该结论仍不完全明确，有待进一步探索。

3.3 EE在心脏相关受体的内化、表达、调节和细胞致敏中的作用 EE还参与许多受体的内吞过程，这些受体在心血管系统中发挥重要作用。蛋白酶活化受体（PAR）是G 蛋白偶联受体［24］，能引起细胞对凝血和抗凝血蛋白酶的反应。与β2-肾上腺素受体一样，激活后的PAR 迅速磷酸化并与信号通路解耦，然后立即内化到EE 中，并被分选到溶酶体进行降解。而未激活的PAR 在细胞表面和EE 之间不断循环，并产生内部受体池，这对补充细胞表面未激活的受体起重要作用，从而促进细胞的再敏化。除此之外，心肌对凝血酶有特异性反应，这说明心肌细胞中存在一种新的凝血酶受体，这种受体可能在心律失常发生中发挥作用，或具有继发于复极延长的抗心律失常作用，其与PAR 以同样的方式内化到EE 中。EE 在血管内皮生长因子（VEGF）的内吞和膜转运中具有相似的分选功能，VEGF 是血管生成的关键因素，在冠状动脉旁路形成中发挥核心作用［25］。

3.4 EE 在心力衰竭中的作用 心肌是一种高度氧化性组织。线粒体融合、裂变、起源和线粒体吞噬不仅与心血管疾病有关，而且对于维持最佳心脏功能至关重要。线粒体功能受损、线粒体吞噬减少及衰老过程与心力衰竭的发生和进展有关［26］。如前文所述，在哺乳动物细胞中，EE 在内涵体和自噬通路中都是必需的，它还可以通过包括选择性自噬、微自噬和内涵体-溶酶体降解等途径清除受损的线粒体［27］。Rab5 依赖的内涵体途径可以清除E3 泛素连接酶Parkin 标记降解的去极化线粒体。此外，Rab5阳性的EE 通过ESCRT 机制将线粒体内化，然后将其传递到溶酶体降解［28］。EE 在线粒体清除中发挥重要作用，有望成为治疗或预防心脏疾病的靶点。

3.5 EE 在病毒侵入心肌细胞中的作用 很多病毒依靠低pH激活融合蛋白，融合蛋白能够将病毒包膜与内涵体膜结合［29］。EE 表面的脂质和蛋白质与病毒融合的完成与将病毒核衣壳释放到细胞质有关［30-31］。EE 酸化不足延迟了禽肉瘤与白血病病毒融合［32］。病毒融合需要酸性的EE 环境，而EE 的成熟必须经过酸化才得以实现，这意味着抑制早期向LE 转化的过程可能会干扰病毒的融合，从而抑制病毒侵入细胞。病毒性心肌炎的发生可能与病毒和宿主细胞膜融合过程紧密相关。如果干扰EE 成熟的过程，可切断病毒侵犯心肌细胞的途径，从而进一步控制病毒性心肌炎的进展。因此，EE有望成为病毒性心肌炎干预治疗的新靶点。

EE能从细胞外环境中接收大分子物质和溶质，通过分选机制决定内吞物质的去向。EE 表面标志物具有特定的蛋白质和脂质成分都在细胞内吞过程中发挥重要的作用。EE因其结构和功能的多样性，在维持心肌细胞正常功能，心脏疾病发生、发展及治疗中具有重要意义，通过对EE的研究也为从分子生物学角度了解心脏疾病的发生机制奠定基础，同时为心脏疾病的药物靶向治疗、分子干预治疗等提供理论依据。