4种五味子木脂素脂质体乳液的体外透皮扩散评价

宿玥祺，刘俊霞

(吉林农业科技学院 生物与制药工程学院，吉林 吉林 132101)

五味子是五味子科植物五味子[Schisandrachinensis(Turcz.)Baill.]的干燥成熟果实[1]，主要有效成分木脂素具有很低的极性，在水中溶解度低，因此在动物实验中必须采用特定的溶媒[2]。脂质体与细胞膜相似度高，适应性好，不影响药物的分子结构和活性，可防止水解酶在体内被破坏[3]。

1 仪器与试剂

仪器：Agilent 1260高效液相色谱仪(1260，美国安捷伦科技有限公司生产)；可调高速匀浆机(FSH-2A，方科仪器有限公司生产)；药物透皮吸收仪(TT-6/TT-8，天津市正通科技有限公司生产)。

试剂：五味子醇甲对照品(MUST-20082908，中国科学院成都生物研究所生产)；胆固醇(20190301，天津市致远化学试剂有限公司生产)；大豆卵磷脂(C10537756，上海麦克林生化科技有限公司生产)；十六烷基三甲基溴化铵(112-02-7，罗恩试剂)。

2 实验方法

2.1 4种脂质体及乳液的制备方法

常规脂质体的制备。在量取的1 mL五味子木脂素提取液中加入大豆卵磷脂600 mg和胆固醇120 mg，用适量的无水乙醇定容至25 mL后摇匀，超声约5～10 min充分溶解，于55 ℃水浴条件下旋转蒸发除去溶剂，直至在茄形瓶瓶壁上有薄膜形成后再加入适量pH=7.0的磷酸盐缓冲溶液进行水化超声，使薄膜层完全脱落，得到脂质体混悬液，于4 ℃下保存[4]。

柔性脂质体的制备。通过超声处理将吐温-80溶解在无水乙醇中，按照吐温-80∶卵磷脂=1∶6定容后混合均匀，制备出浓度为10 mg·mL-1的溶液。依照上述方法制备柔性脂质体[4]。

阴离子脂质体的制备。按制备柔性脂质体混悬液的方法，加入150 mg十二烷基苯磺酸钠，即可得到阴离子脂质体，于4 ℃下保存。

阳离子脂质体的制备。将100 mg十六烷基三甲基溴化铵加入到柔性脂质体混悬液中，即可得到阳离子脂质体，于4 ℃下保存。

乳液的制备。根据五味子木脂素脂质体乳液的拟配方[5]筛选出最优配比为：油相占比15%～30%，促透剂占比0.2%，保湿剂占比1%～5%，乳化剂占比1%～2%，黄原胶占比0.1%～0.2%，苯氧乙醇占比0.5%～1%，将水相加至100%。

精确称量油相(脂质体∶蜂蜡=6∶1)和水相(氮酮、乳化剂OP、山梨醇∶透明质酸钠=1∶1、黄原胶和磷酸缓冲溶液)，在80℃～85℃的条件下加热至融解后把水相倒入到油相中乳化5 min，冷却至40 ℃左右加入防腐剂(苯氧乙醇)，搅拌均匀，得到4种五味子木脂素脂质体乳液[6]。

2.2 小鼠皮肤处理

将选取的健康雄性小鼠用颈椎脱臼法处死，用充气筒给小鼠充气至腹部绷紧，将毛发去除。将小鼠的腹部皮肤剥离后用浸有生理盐水的脱脂棉球清洁皮下脂肪组织与结缔组织，再用蒸馏水、生理盐水反复冲洗，放入生理盐水中，于4 ℃冷藏备用[7]。

2.3 扩散装置及接收液

采用的装置是立式扩散池，结构如图1所示，有效扩散面积为0.635 85 cm2，接收池容量为5 mL。实验前需进行检漏，将合适大小的离体皮肤用弹簧夹固定于扩散池中，角质层一面朝向供给池，真皮层一面朝向接收池，在供给池中加入适量的水，观察水位是否降低，如有渗漏情况则需调整弹簧夹[8]，放置磁力搅拌子，向接收池中注入5 mL接收液(1%吐温-80溶液)，接收池的液体与真皮层之间不能存在气泡。将4种五味子木脂素脂质体乳液添加到供给池中，由于脂质体在达到合适的水合梯度后才能进行自发渗透，需利用薄膜等材料对供给池进行半封口操作[9]。

图1 立式扩散池结构图Fig.1 Structure diagram of vertical diffusion cell

2.4 体外透皮含量测定方法

2.4.1 色谱条件的建立

采用高效液相色谱方法(HPLC)对4种乳液接收液的含量进行分析，色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18(5 μm，4.6×150 mm)；流动相：水(A)-甲醇(B)，洗脱比例0～35 min，68%B；35～40 min，68%～100%B；40～48 min，100%～100%B；48～52 min，100%～68%B；52～60 min，68%～68%B，流速1 mL·min-1，柱温35 ℃，在波长254 nm处进行检测，每次进样10 μL[6]。

2.4.2 标准曲线的绘制

在5 mg五味子醇甲标准品中加入甲醇，制备浓度为0.5 mg·mL-1的混合对照品溶液。取适量混合对照品溶液与甲醇，按照一定比例配制出0.05mg·mL-1、0.1mg·mL-1、0.15mg·mL-1、0.2mg·mL-1、0.25 mg·mL-1的对照品溶液，每次进样10 μL，利用峰面积数据绘制五味子醇甲标准曲线，横坐标X为对照品溶液的浓度，纵坐标Y为色谱峰面积。

2.4.3 样品含量测定

在三批0.1 mL的4种乳液中加入适量甲醇，经10 min超声后加入无水乙醇定容摇匀，即得样品溶液。按“2.4.1”中的色谱条件进行测定，根据绘制的标准曲线计算样品中五味子醇甲的含量[10]。

2.5 4种五味子木脂素脂质体乳液的体外透皮扩散评价

2.5.1 体外透皮试验

将扩散池在温度34 ℃、转速600 rpm·min-1的条件下平衡15 min，分别将1 mL的4种乳液加入到供给池，在第2、4、6、8、10、12、24 h取出1 mL接收液，注入等体积的新鲜接收液，在取出的接收液中加入甲醇定容至5 mL后超声5 min，过孔径为0.22 μm的微孔滤膜后进行含量测定。

2.5.2 单位累积透过量

利用下列公式分别计算出4种乳液的单位累积释放量Qn：

其中，Cn为时间点t时对透皮后所得接收液取样计算的浓度，Ci为时间点t的上一个时间点对透皮扩散后所得接收液取样计算的浓度，Vr为接收池的体积，Vs为所取透皮后接收液的体积，A代表扩散池的有效扩散面积。

3 测定结果与数据结果分析

3.1 标准曲线的绘制

通过“2.4.1”色谱条件下测得的五味子混合标准品色谱峰如图2所示。

注：峰1为五味子醇甲；峰2为五味子醇乙；峰3为五味子甲素；峰4为五味子乙素图2 五味子混合标准品色谱图Fig.2 Chromatogram of mixed standard substance of Schisandra Chinensis

图3 五味子醇甲标准曲线Fig.3 Standard curve of schisandrin

五味子醇甲的标准曲线为Y=21 056X+4.19(R2=0.993 8)，如图3所示，该结果表明在0.05～0.25 mg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。

3.2 体外透皮含量的测定结果

对测定结果进行分析，纵坐标Qn为单位累积释放量，横坐标t为取接收液的时间点，结果如图4所示。

图4 4种五味子木脂素脂质体乳液的体外透皮单位累积透过量曲线Fig.4 Cumulative transmittal curve of transdermal unit in vitro of 4 kinds of lignan liposome lotion

4种五味子木脂素脂质体乳液单位累积透过量随时间的延长而增加，由实验数据可以看出，阴离子脂质体乳液在24 h时单位累积透过量最高，可达66.63 μg·cm-2，且随时间的增加单位累积量呈直线上升，透皮速率最快，而常规脂质体乳液单位累积透过量最低。

4 结束语

将4种脂质体作为木脂素的载体，按照筛选的最优配比制备成乳液，通过体外透皮扩散试验，以HPLC法作为定量方法，对4种乳液的透皮效果进行分析，测量透皮吸收量，精密度高，准确，线性与范围好，透皮效果依次为：阴离子脂质体乳液>阳离子脂质体乳液>柔性脂质体乳液>常规脂质体乳液。经过体外透皮实验初步证明，用脂质体制备的乳液能够促进透皮效果，提高生物利用度。该配方是一种乳剂，没有从基质中释放出任何药物。进行透皮扩散时，皮肤直接关系到药物的透皮作用，配方中甲醇、氮酮作为促透剂也发挥了一定的促进作用。离体皮肤的角质层厚度和毛孔密度都会对透皮效果产生影响；接收液的性质与体内组织液性质越接近透皮效果越好。处理后的鼠皮存放时间也有一定的影响，存放时间过长则难以起到生物屏障的作用，所以实验应尽量控制在24 h内完成。将脂质体作为载体进行体外透皮扩散，可促进五味子中活性成分的吸收效果或延长在皮内的滞留时间，具有良好的研究价值和广阔的发展空间。