猪繁殖与呼吸综合征病毒分子生物学检测方法研究进展

陈欣雅，申秋平，宋春雷，庄林林★

（江苏农林职业技术学院，江苏 句容 212400）

猪繁殖与呼吸综合征 （Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）引起的以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸衰竭为主要特征的高致病性传染病。目前，PRRSV 已成为影响全球养猪业发展的重要疫病之一，给相关行业造成巨大的经济损失。

PRRSV 为单股正链RNA 病毒，属动脉病毒科、动脉炎病毒属。其基因组全长约15 kb。目前，研究发现该病毒存在7 种结构蛋白，分别为N、M、GP2a、GP2b、GP3、GP4 和GP5。基因组学研究表明，PRRSV 可分为2 种基因型，即以VR-2332 株为代表的美洲型（NA-PRRSV）和以LV株为代表的欧洲型（EU-PRRSV）。我国主要的PRRSV 流行株为美洲型，但近几年欧洲型也逐渐被发现。PRRSV 极其容易发生突变，目前已形成多种变异毒株循环流行的复杂态势。我国主要使用高致病性毒株的弱毒疫苗来防控PRRSV，但该疫苗对当前流行株保护力有限，导致疫苗株与流行株之间常发生重组，对PRRSV的准确鉴定和科学防控带来了极大挑战。近年来，PRRS 疫情愈演愈烈，且有变异株毒力增强的趋势。因此，临床上迫切需要提高快速诊断PRRSV 的能力。

作为病原微生物精准检测的重要可选解决方案，分子生物学技术在动植物病原体快速检测、食品安全、转基因鉴别、环境监测、遗传性疾病筛查等方面发挥着越来越重要的作用。目前，根据已发表的相关文献，应用于PRRSV 快速检测的分子生物学方法主要包括聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）、荧 光 定 量PCR、环介导等温扩增、依赖核酸序列扩增、原位杂交、基因芯片、重组酶聚合酶扩增以及测序技术等。本文就上述方法的研究进展进行综述，以期为猪繁殖与呼吸综合征病毒精准检测及科学防控提供可选方法参考。

1 聚合酶链式反应（PCR）

1.1 逆转录PCR

逆 转 录PCR （Reverse transcription PCR，RT-PCR）是一种将RNA 逆转录成cDNA 后再进行核酸扩增的聚合酶链式反应，主要用于RNA 病原体的快速扩增及检测。该技术可快速鉴别高致病性 PRRSV （High pathogenicity PRRSV，HP-PRRSV）与经典PRRSV（Classical PRRSV，C-PRRSV）。Yang 等建立了一种一步法RT-PCR 方法。该方法可在症状出现前2 天检测到病毒，并可在2 小时内完成。且对于HPPRRSV 和C-PRRSV 的检测灵敏度高，均可达25 copies/微升，为鉴别和预防PRRSV 感染提供了一种快速的核酸检测方法。赵耘等基于LV、VR-2332 株ORF7 基因保守区域设计引物建立了一种套式RT-PCR 方法以准确鉴定2 种亚群的PRRSV，且该方法的敏感性比RT-PCR 高10000 倍。Li 等 建 立 的RT-PCR 方 法 可 用 于PRRSV 感染的细胞培养上清液和组织样品，可以同时鉴别NA-PRRSV 的三种亚型并具有较高的特异性。顾海洋等根据HP-PRRSVNSP2 基因上87bp 连续缺失的特点，建立了一种RT-PCR的方法，可快速、准确检测出HP-PRRSV。

1.2 荧光定量PCR

1.2.1 染料法

实时荧光定量PCR （Real-time flurocentqualitative PCR，qPCR）的发展为病毒快速、精准检测提供了新的重要技术支持。荧光定量PCR可以实时对核酸进行高灵敏度和特异性的定量。常用的荧光染料包括饱和荧光染料（如Eva Green、SolisGreen）和非饱和荧光染料（如SYBR Green I）。同时，染料法可通过溶解曲线来辅助分析PCR 产物。Martínez 等使用基于熔融曲线分析的反转录定量PCR 方法 （RT-qPCR）对PRRSV 进行快速检测和分型。结果表明，该方法可高效检测PRRSV，并能准确鉴别EU-PRRSV和NA-PRRSV。Zheng 等开发了一种基于SYBR Green I 的RT-qPCR 方法，可用于同时检测和区分HP-PRRSV 和C-PRRSV。该方法可在一小时内完成，且快速、灵敏、成本可控。单晶晶等以不同浓度的含有PRRSV-N 基因序列的质粒为模板，测试SYBR Green I 法荧光定量PCR 的扩增性能。结果表明，该qPCR 方法的扩增效率为98.2%，且灵敏度比常规PCR 方法高5 倍，并具有良好的可重复性。Zheng 等利用SYBR Green建立了一种双重实时荧光定量PCR 方法，可用于同时检测PRRSV 和猪圆环病毒3 型（Porcine circovirus type 3，PCV3）。该研究通过对采集的33 份具有呼吸和生殖衰竭症状的猪肺样本进行检测，并与常规PCR 方法作对比。结果显示，两种方法检出PRRSV 和PCV3 的阳性率一致，且荧光定量PCR 方法灵敏度优于常规PCR。王荣等建立的基于SYBR Green I 染料法的RTqPCR 可以同时检测96 份临床样品中的PRRSV并可在3 小时内完成，具有简单、方便、高效等优势。

1.2.2 探针法

基于探针的荧光定量PCR 方法具有特异性强的特点，且适用于多靶标同时检测。2018 年，于新友等根据猪瘟病毒 （Classical swine fever virus，CSFV）和PRRSV 基因组特异性保守区域建立了一种基于TaqMan 探针的RT-qPCR 方法。该方法检测CSFV 和PRRSV 的灵敏度分别可达0.25 和1.99TCID50/100 微升。Xiao 等证明SYBR Green I 和TaqMan 探针的实时荧光定量PCR 方法都可用于检测和区分HP-PRRSV 和C-PRRSV。同时对535 份样品进行了RT-qPCR和常规RT-PCR 检测，结果表明，TaqMan 探针法的检出率最高，适用于临床样品中PRRSV 的快速准确检测及鉴别。

1.3 逆转录环介导等温扩增技术

环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）是2000 年由Notomi 等学者发明的一种核酸等温扩增技术。根据靶序列设计2 对扩增引物（1 对外引物和1 对内引物），利用高链置换活性的DNA 聚合酶 （Bst DNA polymerase）可在恒温条件（61℃～65℃）下1 小时内将靶序列数量扩增至109～1010倍。Zhang 等建立了了一种逆转录LAMP （Reverse transcription LAMP，RT-LAMP）方法以对NA-PRRSV 进行快速检测。该方法可特异性识别NA-PRRSV，而与PCV 2、CSFV、猪 流 感 病 毒 （Swine influenza virus，SIV）和猪轮状病毒等无交叉反应性。使用该方法检测临床可疑样品中的NA-PRRSV，阳性率约为79%（33/42），与使用猪肺泡巨噬细胞分离的结果一致。Guo 等使用生物素和荧光素异硫氰酸酯分别标记环引物，开发出一种基于RT-LAMP 的核酸试纸条方法以即时检测HPPRRSV。整个检测过程可以在50 分钟内完成。通过检测43 份临床样本并与RT-PCR 方法进行比较，阳性率分别为32.56%和27.91%。结果证实，该技术可以用于HP-PRRSV 的快速检测。此外，该方法可用于在疫情暴发的早期阶段快速检测HP-PRRSV，具有高度的精准性。Chen 等针对PRRSV N 基因的6 个区域设计了4 条的特异性引物。恒温反应1 小时后，仅含有PRRSV的样品可见典型的梯状条带，而其他病毒株无扩增产物，表明所建立的RT-LAMP 方法适用于临床样品中PRRSV 的快速检测。Li 等根据PRRSVORF6 基因建立了一种可快速检测PRRSV 的RT-LAMP 方法，并通过琼脂糖凝胶电泳及比色法来观察扩增产物。结果表明，RTLAMP 法可检测出22 份不同来源的PRRSV 分离株，且与PCV2、SIV、CSFV 和猪流行性腹泻病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）无交叉反应，敏感性为91.3%。该研究为PRRSV 的检测提供了一种简单且快速的检测方法。

1.4 依赖核酸序列的扩增技术

依赖核酸序列的扩增 （Nuclear acid sequence-based amplification，NASBA）是一种灵敏高效的RNA 扩增分子工具，目前广泛应用于临床诊断。同时具有操作便捷、扩增效率高、反应时间短的优点。NASBA 可在2 小时内将RNA 模板扩增109倍。NASBA 具有高效性，使反应时间大大缩短，转录结果更准确。并且该技术不易受到环境影响，适于现场即时检测。梁海霞等基于NASBA 建立了一种可检测HP-PRRSV 的酶联免疫吸附方法（NASBA-ELISA）。结果表明，该方法可特异性检测HP-PRRSV，而与C-PRRSV 及其他猪源病毒无交叉反应性，适用于临床样品中HP-PRRSV 的高效检测。

1.5 原位杂交技术

原位杂交技术（In situ hybridization，ISH）用于识别基因的位置，定位和检测细胞中特定的DNA 序列。该技术可在组织切片、单细胞或染色体中特异性识别DNA 或RNA。目前，原位杂交技术已经广泛用于科学研究及临床诊断。为深入探究PRRSV 在公猪体内的持续存在机制，Shin 等通过使用地高辛标记的RNA 探针进行原位杂交（ISH）以研究PRRSV 感染的组织分布和部位，并将ISH 结果与反转录巢式聚合酶链反应（RT-nested PCR）的结果进行比较。结果表明PRRSV 在睾丸中的感染量可能较为有限，且不一定构成精液中的主要病毒源。Larochelle 等比较了ISH 法和免疫组化法在检测石蜡包埋组织中PRRSV 的效果。实验感染猪组织和田间病例组织的检测结果表明，ISH 技术比免疫组化法灵敏度更高，可为PRRS 的精准检测提供了一种快速、灵敏的方法。

1.6 基因芯片

基因芯片具有信息容量大、操作简便、反应迅速等特点，近年来已成为研究热点。随着分子生物学和基因组学的进一步研究与发展，大量的基因芯片得到了发展和应用。目前，基因芯片技术已经逐步应用于PRRSV 的快速检测及鉴别分析，杨林等采用了不对称PCR 方法获得了荧光标记单链杂交模板，从而建立了针对PRRSV 基因芯片检测方法。通过对39 份样品进行检测验证，证明了该方法的可行性。郭焕成等根据PRRSV NSP2 基因缺失株与C-PRRSV 株的核苷酸序列设计寡核苷酸探针与基因缺失序列的探针，构建了一种方便高效的基因芯片。经实验验证，该芯片具有高度特异性，可以精准鉴别临床样品中的HP-PRRSVNSP2 基因缺失株。

1.7 重组酶聚合酶扩增

重组酶聚合酶扩增 （Recombinase polymerase amplification，RPA）是一种近年来发展起来的新型等温基因扩增技术。该技术利用能结合单链核酸的重组酶、单链结合蛋白和链置换聚合酶可在37℃～42℃条件下实现对目标基因进行指数式扩增。这种方法可实现快速、灵敏和多重分子检测，并可用于现场即时诊断（Pointof-care testing，POCT）。Yang 等针对HP-PRRSV进行快速检测，开发了一种高效的实时RT-RPA检测方法。敏感性分析表明，该方法的检测限为70 拷贝/反应。该RT-RPA 方法可特异性扩增HP-PRRSV，与其他病毒（C-PRRSV、CSFV、PRV和FMDV）没有交叉反应性，适用于临床样品中HP-PRRSV 的精准检测。Wang 等开发了一种荧光RT-RPA 方法。反应过程可在40°C 条件下20分钟内完成。RT-RPA 方法可以准确检测CPRRSV 和HP-PRRSV。该研究测试了60 份临床样品并与实时RT-PCR 进行比较以评估其性能。结果表明，RT-RPA 的检出率为86.6%（52/60），优于实时RT-PCR（83.3%，50/60）。Liu 等联合应用RT-RPA、Cas12a 系统以及单链DNA 荧光淬灭（ssDNA-FQ）报告分子建立了一种高灵敏度的PRRSV 检测方法。该方法可以在25 分钟内实现PRRSV 可视检测，且检测反应可以在单管中完成。灵敏度可达单拷贝/反应，与其他猪病毒无交叉反应。经RT-qPCR 和CRISPR/Cas12a 方法验证，该方法检测结果高度准确。Tian 等结合RT-RPA 与侧向层析试纸（Lateral flow dipstick，LFD）建立了一种检测NA-PRRSV的方法（RT-RPA-LFD）。该方法对中国流行的NA-PRRSV 株具有高度特异性，且与PRV、PCV 2、CSFV 和PEDV 无交叉反应性。临床样本验证结果表明，该方法检测结果与RT-qPCR 一致，具有临床应用价值。

1.8 测序技术

近年来，测序技术作为一种新的核酸诊断工具，为PCR 在临床样品诊断中的应用提供极大的帮助，如菌株信息。目前，测序技术已成功地应用于病毒学的各个领域，如病毒全基因组测序、新病毒的发现、鉴定和流行病学调查等。病毒基因组测序的应用不仅为检测PRRSV 提供了新的可选工具，同时也为研究人员更好地了解PRRSV 的流行病学以及病毒如何传播和进化提供了有力的技术支持。Tan 等利用RNA测 序 技 术 （Oxford Nanopore MinION）检 测PRRSV 毒株，准确率高达99.9%，且成功鉴别了一份样品中存在的多个共感染毒株。该技术最低可从含104个病毒拷贝的临床样本中获得PRRSV 株系信息。Nan 等利用Illumina-MiSeq测序平台，对感染PRRSV 的猪支气管肺泡灌洗液、黏膜和盲肠中的微生物群进行测序，以分析微生物群对猪繁殖与呼吸综合征产生与扩散的影响。通过微生物生态学的定量分析表明，PRRSV 感染猪肺部的优势菌群为副猪嗜血杆菌和猪支原体，相对丰度分别为35%～48%和27%～41%，实验结果与临床观察一致，即PRRS 患病猪通常共感染其他细菌 （如嗜血杆菌和支原体）。测序技术为检测与诊断PRRSV 提供了重要方法支持。

1.9 小结与展望

猪繁殖与呼吸综合征严重危害生猪养殖产业的发展。当前，由于PRRSV 基因组的高突变率，给全世界范围内有效防控PRRSV 带来极大挑战。快速、准确诊断对于猪繁殖与呼吸综合征科学防控具有十分重要的意义。现有多种分子生物学方法可用于猪繁殖与呼吸综合征的检测，但这些方法各有优缺点，应根据不同的实际检测需要选择合适的检测技术。随着分子技术的不断发展及交叉学科的融合，分子检测方法必将得到优化与发展，新型智能化及一体化设备也将不断诞生，这些将为猪繁殖与呼吸综合征病毒的科学检测提供新的有力技术与工具支撑。