不同DAB 显色液对免疫组化结果的对比分析

陈洁 章诗伟

（湖北省中西医结合医院病理科 湖北武汉 420000）

免疫组织化学是一种常见的病理技术，是应用免疫学原理，基于抗原抗体特异性反应，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的研究，又称为免疫细胞化学技术（IHC）。许多疾病除了依靠组织形态外，还必须依靠免疫组化[1-3]才能明确诊断。而免疫组化步骤较多，除了常规组织固定、抗体的选择可能影响免疫组化结果外[4-5]，显色作为最后一步，DAB 显色液的优劣也能直接影响免疫组化结果。因此，既要得到最优的结果，又能使成本得到控制。基于此，将DAB试用装与现用的显色液进行对比，观察试用装显色效果，判断能否代替现用的显色液，达到降低成本的目的。

1 材料与方法

1.1 设备

切片机、一次性刀片、高压锅、免疫组化专用孵育盒、烤箱、奥林巴斯显微镜。

1.2 试剂

脱蜡剂、EDTA（浓缩型）、无水酒精、95%酒精、去离子水、PBS 粉末、吐温-20、苏木素、0.5%盐酸酒精、中性树胶等。

1.3 其他

洗瓶、黏附载玻片、盖玻片等。

1.4 材料

选择2021 年5 月1 日～2021 年12 月30 日的蜡块并切白片，其中不同宫颈组织并切6 张白片（p16、Ki-67、HPV 各2 张）、胃镜组织切14 张白片（PCK、CDX2、CD38 各4 张，Calponin2 张）、结肠活检组织2 张 (均PCK) 及肾上腺穿刺组织4 张（CD20、Ki-67 各2 张），相同组织白片随机分为两组，分别为A 组（试用装）和B 组（现用装）。

1.5 免疫组化流程

（1）切片及烤片：用免疫组化专用黏附载玻片，切片厚度3 微米，烤片65℃、120 分钟。

（2）脱蜡：专用脱蜡剂2 缸，均37℃、10 分钟/缸，然后依次经过无水酒精2 缸、95%酒精1 缸、80%酒精1 缸。大约0.5 分钟/缸。

（3）冲洗：自来水冲洗后先用去离子水洗2 次，3分钟/次。然后用1×PBST冲洗，3分钟/次，共3次。

（4）高压修复：EDTA 高压修复2.5 分钟。修复结束后，待锅内的液体降至常温后，用免疫组织化学专用笔划线，1×PBST 冲洗，3 分钟/次，共3 次。

（5）内源性过氧化物酶阻断剂：常温孵育约10分钟。1×PBST 冲洗3 次，3 分钟/次。

（6）一抗：甩干残余液体，在同编号的白片上滴加相同的适量抗体，使组织被充分覆盖，37℃孵育50 分钟。孵育结束后1×PBST 冲洗3 次，3 分钟/次，甩干。

（7）二抗：室温孵育30 分钟。孵育结束后用1×PBST 冲洗3 次，3 分钟/次。

注：图A：试用装；图B：现用装。图片均×40 倍。图1：胃活检组织，A 图中腺体显色略浅，而B 图显色稍深，看不到清晰的腺体。此外，由于B 图显色偏深，使得背景颜色整体偏暗。图2- 图3：均为宫颈组织。图2A 的宫颈上皮及图3A 基底层细胞显色均连续，图3B 局部存在非特异性着色。图4- 图6：胃活检组织。两组阳性区域略有差异。图4B 存在非特异性着色导致腺体结构不清。

（8）显色液配制：按照说明书配制两种显色液，轻轻吹打混4℃备用。

（9）显色：分别滴加显色液适量，B 组7 分钟后终止显色，A 组在显微镜下观察，根据对照，染色时间约在5.5 分钟时终止显色。

（10）复染：相同的切片一起复染。苏木素2 分钟，自来水冲洗，0.5%盐酸酒精分化数秒，自来水冲洗返蓝，甩干残余水分后无水酒精内静置约1 分钟，冷风吹干。

（11）封片及结果判读。

2 结果

2.1 观察指标

观察两组切片阳性区域是否一致，是否存在背景着色、非特异性染色等。

2.2 结果

整体来看，两组切片阳性区域基本保持一致。但是，不同组织的局部区域染色稍有差异（具体见图1-图6 所示，图片均×40）。图1：横结肠活检组织（PCK），A 图中腺体显色略浅，而B 图显色稍深，看不到清晰的腺体结构。此外，由于B 图显色偏深，使得背景颜色整体偏暗。图2-图3：均为宫颈组织，依次为HPV 及Ki-67。图2A 的宫颈上皮及图3A 基底层细胞显色均连续，此外，图3B 局部存在非特异性着色。图4-图6：均为胃黏膜活检组织，依次为CDX2、CD38、Calponin。两幅图对比发现A 图中局部呈现阳性区域的地方，在B 图中仅为部分区域显色，而且着色整体偏浅。

3 讨论

DAB，又称4,4-二氨基联苯胺，多环芳香胺的衍生物，是免疫组化常用的显色液，是世界卫生组织公布的1 类致癌物。它主要是和蛋白质的NH2或SH 集团结合，形成稳定的N-N 或N-S 键后呈棕黄色，继而对目标蛋白进行定位。本次实验发现，虽然试用装的DAB 显色液显色效果比现用的显色液显色偏深，但是无背景色及非特异性着色。A 组试用的DAB 显色液可以通过多次摸索找到最佳显色时间。此外，虽然有些显色区域有差异，但是不是目标区域，并不会影响最终诊断。那么，为什么不同的显色液，其显色的深浅有差异呢？这或许除了跟显色时间有关，还跟不同的显色液中DAB 的浓度及其溶液的PH 值有关系[6-8]。那么，接下来，关于试用装DAB 显色偏深的问题，可以摸索合适的浓度及显色时间。

综上所述，试用装DAB 可以取代现用的显色液运用到日常工作中，达到降低成本的目的。