曲霉、酵母菌和乳酸菌固态发酵对无花果多酚和黄酮类化合物抗氧化活性的影响

廖 颖，尹礼国，斯朝金，帖 余，蒋杨丹，赵甲元

(1.固态发酵资源利用四川省重点实验室，四川 宜宾 644000; 2.四川师范大学，成都 610101)

【研究意义】无花果(FicuscaricaL.)是桑科落叶乔木，自公元前3000年起就因其食用价值而被栽培[1-2]。无花果具有抗氧化、抗菌、抗癌、降糖、保肝、利尿和抗炎等作用，因此也被用于传统药物[3-5]。无花果的药理特性主要归因于无花果中的多酚和黄酮类化合物[6]。目前，针对无花果的研究主要集中于多酚和黄酮类化合物的组成、化学特性、抗氧化活性和分离方法等[7]，微生物固态发酵对无花果中多酚和黄酮类化合物的影响研究较少。【前人研究进展】发酵是一种由微生物驱动的过程。研究显示，微生物发酵可以将食物中的初始多酚和黄酮类化合物转化为更具生物活性的化合物[8-10]。张云娟等[11]研究发现，鲁氏毛霉(Mucorrouxianus)可以提高辣木叶的营养成分含量以及抗氧化能力。不仅如此，多项研究证实霉菌、酵母菌和乳酸菌可以改变水果和蔬菜中多酚和黄酮类化合物的组成和抗氧化活性[12-14]。米根霉(Rhizopusoryzae)、木霉(Trichodermasp.)、黑曲霉HT4(AspergillusnigerHT4)和黑曲霉GH1(AspergillusnigerGH1)可增加水果和蔬菜中的总多酚含量[7-8,10,15-16]；酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)发酵会改变食物中多酚和黄酮类化合物的含量和组成[17]。【本研究切入点】现有研究倾向单一菌株发酵引起底物成分的变化，却很少有研究集中比较曲霉、酵母菌和乳球菌发酵引起的果蔬中多酚和黄酮类化合物含量和抗氧化活性变化的差异。因此，研究曲霉、酵母菌和乳球菌发酵对无花果多酚和黄酮类化合物含量及抗氧化活性的影响的区别十分重要。【拟解决的关键问题】本研究分别用米曲霉(Aspergillusoryzae)、黑曲霉(Aspergillusniger)、酿酒酵母、红酵母NY5(RhodotorulaglutinisNY5)和乳球菌(Lactococcusgarvieae)对无花果进行固态发酵，并对其多酚和黄酮类化合物的含量、组成和抗氧化活性进行分析，研究曲霉、酵母菌和乳酸菌在提高无花果中多酚和黄酮类化合物含量和抗氧化活性的效率及发酵后的成分差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

冻干无花果购自威海市金宝食品科技有限公司(中国威海市)，切成直径0.3～0.5 cm的小块。

菌种：分别从酱油曲、大豆糊、酒曲、酸奶和胡萝卜素的发酵液中分离出米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌，菌株由四川师范大学食品功能及加工应用研究所分离、纯化、鉴定和保藏。

实验试剂：马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)、De Man Rogosa Sharpe(MRS)肉汤、MRS琼脂购自北京欧博思生物科技有限公司。1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH≥97%)购自格尔默生物技术有限公司(美国宾夕法尼亚州)。Folin-Ciocalteu试剂，没食子酸和芦丁购自西格玛奥德里奇(美国密苏里州美国密苏里州圣路易斯)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌悬液制备 将米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌活化后，米曲霉和黑曲霉分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面，30 ℃培养5 d，收集孢子，将其悬浮在无菌的0.9% NaCl溶液中，制备1.0×107cfu/mL的孢子悬液备用。将酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌分别接种到装有30 mL马铃薯葡萄糖肉汤和MRS肉汤的100 mL锥形瓶中，在30 ℃、180 r/min培养24 h，10 000 r/min、4 ℃离心10 min后，收集菌株细胞并将其悬浮在无菌NaCl溶液(0.9%)中，配制成浓度为1.0×107cfu/mL的菌悬液备用。

1.2.2 固态发酵 采用Buenrostro等[16]报道的方法发酵冻干无花果。将2 mL米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌的菌或孢子悬液分别接种至10 g冻干无花果(已灭菌)中，用无菌水浸润使其含有70%的水分。每组设置3个生物学重复，在30 ℃恒温发酵7 d[18]。以接种2 mL无菌NaCl溶液(0.9%)为对照组。分别取0、1、3、5、7 d发酵产物，冷冻干燥备用。

1.2.3 样品制备 参照Slatnar等[3]的方法进行样品制备。取各组中1 g冻干的发酵产物和适量的乙醇(95%，v/v)转移到200 mL棕色锥形烧瓶中，40 ℃超声处理(40 kHz和400 W)30 min，用95%乙醇在25 ℃条件下定容至200 mL。将混合物以8000 r/min离心20 min后，收集上清液，并通过0.45 μm膜滤器过滤得到无花果发酵后提取物。每组提取物均分为两部分，一部分用于测定多酚和黄酮类化合物的含量及抗氧化活性，另一部分运用液相色谱质谱联用仪(LC-MS)测定提取物中多酚和黄酮类物质的成分。

1.2.4 总酚含量测定 采用Folin Ciocalteu法[6]测定提取物中的总酚含量。总酚含量以每克冻干无花果中所含没食子酸当量表示g。以没食子酸浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，获得标准曲线方程为y=0.4507x-0.0042，R2=0.9987，在测定范围内线性关系良好，可用于多酚含量的测定。

1.2.5 总黄酮含量测定 采用三氯化铝法[6]测定提取物中的总黄酮含量。总黄酮含量以每克冻干无花果中芦丁当量表示。以芦丁浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，获得标准曲线方程：y=0.013x-0.0042，R2=0.9987，在测定范围内线性关系良好，可用于黄酮含量的测定。

1.2.6 DPPH自由基清除能力的测定 使用DPPH自由基清除法[2]测定提取物清除自由基的能力。以甲醇为空白溶液，DPPH溶液为对照，在517 nm(Schimadzu-UV-2401PC)处测量吸光值。用以下公式计算不同实验组提取物的自由基清除能力。

式中，OD对照为DPPH溶液的吸光度，OD空白为纯甲醇溶液的吸光度，OD样品为添加不同浓度提取物的DPPH溶液吸光度。

1.2.7 还原力测定 使用铁氰化物还原法测定提取物的还原能力[12]。以反应混合物在700 nm处的吸光值表示其还原能力(Schimadzu-UV-2401PC)。

1.2.8 多酚类和黄酮类化合物的测定 使用LC-MS(Agilent, Santa Clara, CA, USA)分析提取物中多酚和黄酮类物质。色谱条件：WatersXSelectRHSST3柱(2.5 μm,100 mm×2.1 mm)，流动相为0.1%甲酸的水溶液(A)，流动相为0.1%甲酸的乙腈溶液(B)，流速为0.35 mL/min，柱温为25 ℃，进样量为2 μL，梯度洗脱条件优化为0～2 min，5% B；2～13 min，5%～95% B；13～15 min，95% B，处理时间为5 min。质谱在正负离子模式下进行。优化参数：毛细管电压为正模式4 kV，负模式3.5 kV；干燥气体流量为10 L/min；气体温度为325 ℃；喷雾器压力为20 psi；破碎器电压为120 V；撇沫器电压为45 V；质量范围为m/z=100～1700。在质谱采集过程中使用参考离子以确保质量精度。正离子模式下的参考离子为121.0509922.0098；负离子模式为112.98561033.9981。

1.2.9 多酚黄酮类物质主成分分析 使用SIMCA-P14.1软件和主成分分析法(PCA)对提取物中的多酚和黄酮类的成分进行分析。

2 结果与分析

2.1 微生物发酵对冻干无花果总酚含量的影响

如表1所示，与0 d相比，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵均能显著提高冻干无花果中的多酚类物质含量(P<0.05)。其中米曲霉和黑曲霉发酵7 d后，总酚含量较0 d分别提高3.59和4.01 mg/g(P<0.05)。酿酒酵母发酵7 d后，总多酚含量较0 d增加1.77 mg/g(P<0.05)。红酵母NY5发酵0～7 d，从第3天开始才与对照组具有显著差异(P<0.05)，发酵结束后总多酚含量较0 d提高1.24 mg/g(P<0.05)。乳球菌发酵7 d后，总酚含量较0 d提高4.30 mg/g(P<0.05)。说明,在受试时间范围内的所有实验组中，提高冻干无花果中总多酚含量能力的菌株排序为乳球菌>黑曲霉>米曲霉>酿酒酵母>红酵母NY5。

表1 微生物发酵对冻干无花果总多酚含量的影响

2.2 微生物发酵对冻干无花果总黄酮含量的影响

通过检测提取物中的总黄酮含量来表征发酵后冻干无花果中的总黄酮含量(表2)。与0 d相比，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵均能显著增加冻干无花果中时黄酮类物质的含量(P<0.05)。米曲霉发酵7 d时，总黄酮含量较0 d增加3.99 mg/g(P<0.05)。黑曲霉发酵7 d时，总黄酮含量较0 d增加2.60 mg/g(P<0.05)。酿酒酵母发酵7 d时，总黄酮含量较0 d增加3.12 mg/g(P<0.05)。红酵母NY5发酵7 d时，总黄酮含量较0 d增加2.20 mg/g(P<0.05)。乳球菌和发酵7 d时，总黄酮含量较0 d提高2.39 mg/g(P<0.05)。说明，在受试时间范围内的所有实验组中，提高冻干无花果中总黄酮含量能力的菌株排序为米曲霉>酿酒酵母>黑曲霉>乳球菌>红酵母NY5。

表2 微生物发酵对冻干无花果总黄酮含量的影响

2.3 微生物发酵对冻干无花果DPPH自由基清除能力的影响

DPPH是一种常用的体外抗氧化能力评价的自由基。通过检测提取物的DPPH清除能力来表征发酵后冻干无花果的DPPH清除能力(表3)。与0 d相比，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵均能显著增加冻干无花果的DPPH清除能力(P<0.05)。米曲霉发酵7 d时，对DPPH的清除率较0 d提高33.74%(P<0.05)；黑曲霉发酵7 d时，对DPPH的清除率较0 d提高33.76%(P<0.05)；酿酒酵母发酵7 d时，对DPPH的清除率较0 d提高27.95%(P<0.05)；红酵母NY5发酵7 d时,对DPPH的清除率较0 d提升26.15%(P<0.05)。乳球菌发酵7 d时，对DPPH的清除率较0 d增加37.63%(P<0.05)。说明，在受试时间范围内的所有实验组中，提高冻干无花果DPPH清除能力的菌株排序为乳球菌>黑曲霉>米曲霉>酿酒酵母>红酵母NY5。

表3 微生物发酵对冻干无花果DPPH清除能力的影响

2.4 微生物发酵对冻干无花果还原能力的影响

通过检测提取物的还原能力来表征发酵后冻干无花果的还原能力(表4)。与0 d相比，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵均显著提升冻干无花果的还原能力(P<0.05)。其中，提升还原能力最强的是乳球菌组，A700较0 d提升12.50倍(P<0.05)。其次是米曲霉和黑曲霉组，A700较0 d均提升10.50倍(P<0.05)。相对而言，对A700提升能力较差的是酿酒酵母组和红酵母NY5组，提升率分别为0 d的6.00和5.00倍(P<0.05)。说明，在受试时间范围内的所有实验组中，提高冻干无花果还原能力的菌株排序为乳球菌>米曲霉=黑曲霉>酿酒酵母>红酵母NY5。

表4 微生物发酵对冻干无花果还原能力的影响

2.5 发酵提取物中多酚和黄酮类物质的成分分析

通过LC-MS测定经米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵的冻干无花果提取物中的多酚和黄酮类成分，所有实验组中均检测到47种相同的化合物(表5)。对照组中检测出了除匙羹藤酸I之外的其余46种化合物。与对照组相比，在米曲霉组中检测出包括对羟基苯甲醇在内的27种含量升高的化合物，包括4-庚基苯酚在内的20种含量降低的化合物；在黑曲霉组中检出出包括对羟基苯甲醇在内的18种含量升高的化合物，包括4-庚基苯酚在内的29种含量降低的化合物；在酿酒酵母组中检测出包括对羟基苯甲醇在内的22种含量升高的化合物，包括3-羟基肉桂酸在内的25种含量降低的化合物；在红酵母NY5组中检测出包括对羟基苯甲醇在内的15种含量升高的化合物，包括3-羟基肉桂酸在内的32种含量降低的化合物；在乳球菌组中检测出包括对羟基苯甲醇在内的27种含量升高的化合物，包括4-丙基-2,6-二甲氧基苯酚在内的20种含量降低的化合物。说明，不同菌株发酵时，消耗底物与产生的产物具有较大的差异。除此之外，不同的菌株发酵冻干无花果后的提取物具有不同的自由基清除能力和还原能力是由不同的化合物组成所导致的。

表5 发酵7 d后无花果提取物中的主要多酚和黄酮类化合物

2.6 主成分分析

从图1可知，米曲霉组、黑曲霉组、酿酒酵母组、红酵母NY5组和乳球菌组发酵的样品彼此能够明显区分，相同处理的生物学重复组能够聚集。米曲霉组、黑曲霉组、酿酒酵母组和乳球菌组的样品位于阳性PC1区域，红酵母NY5组和对照组位于阴性PC1区域。说明，相比其余各组，红酵母NY5组与对照组之间相对差异较小，预示着红酵母NY5组的提取物可能具有相对较差的自由基清除能力与还原能力。

图1 提取物中多酚类和黄酮类成分的主成分分析

3 讨 论

随着发酵时间的延长，与对照相比，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌处理的冻干无花果样品中酚类化合物含量增加，说明这5个菌株均能提高冻干无花果中酚类化合物的含量，这与前人的研究类似[3,8,12]。米曲霉和黑曲霉能显著增加冻干无花果中的多酚含量，原因可能是在发酵时丝状真菌可以通过产生淀粉酶、糖苷酶和木聚糖酶从而水解糖苷键，使结合状态的多酚得以释放和游离[24-25]。酿酒酵母和红酵母NY5也能增加冻干无花果中的总酚含量，原因可能是酵母的代谢会产生分解植物细胞壁的解聚酶，例如酯酶、糖苷酶、多糖降解酶等。据报道，番石榴叶茶经酿酒酵母发酵后，总酚含量显著增加[26]。同时也有研究表明，酵母可以导致葡萄酒中酚类含量降低[27]。这可能是因为酵母在酒精发酵和食品发酵中的代谢不同。根据Sirilin等[19]的研究，通过副干酪乳杆菌(Syzygiumcumini)发酵6个月后，红豆果实中总酚含量增加了85.71%。主要原因是，很多乳酸菌物种能够对膳食酚类化合物进行去糖基化、去酯化、去羧化和去甲基化[20]，因此，乳酸菌发酵后水果和蔬菜的总酚含量可增加1.5～8.0倍[21-23]。综上，米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌均能显著增加冻干无花果中的总多酚含量，但结合实验结果，乳球菌是增加总酚含量的最有效菌株。这是因为生物转化酚类化合物的酶在霉菌、酵母菌和乳酸菌中有所不同[28]。酵母菌可以有效地降解没食子鞣质，但对于高分子量化合物，这种能力会大大减弱[14,28-29]。而细菌和霉菌可以降解没食子鞣质和鞣花单宁[5,28-29]，所以乳球菌可能比黑曲霉和米曲霉更有效。

图2 微生物发酵后提取物中的主要化合物

米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵过程中无花果中的总黄酮含量都随着时间的推移而增加，因为一些微生物可以将复杂的化合物水解成更简单、更具生物活性的黄酮类化合物[21]，一些微生物可以合成异黄酮和苷元异黄酮[15,28]。此前也有类似的报道，Lee等[15]指出乳酸菌合成了异黄酮和苷元异黄酮。Wang等[26]报道显示霉菌和酵母菌可显著增加可溶性黄酮类含量。本研究中，米曲霉和酿酒酵母在提高黄酮类含量方面比其他菌株更有效，这可能归因于不同的活性酶作用的效果。乳酸菌主要由β-葡萄糖苷酶合成黄酮类，而霉菌和酵母菌则通过产生单宁酰基水解酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶和半纤维素将黄酮类苷元转化为黄酮苷元[8,13,15,26]。

酚类和黄酮类化合物作为重要的抗氧化剂，可以防止食物的自氧化，并中和人体中产生的大量自由基[30-31]。本研究中，通过DPPH自由基清除实验和铁氰化物还原2种不同的分析方法测量了由米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵冻干无花果得到的提取物中的多酚和黄酮类化合物的抗氧化活性。经米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵7 d后，均能显著提升DPPH的清除率，表明这些菌株的发酵可以改善提取物的DPPH清除能力。其中，经乳球菌发酵的提取物清除DPPH的能力最强，同时乳球菌也是最有效的A700改良菌株。而米曲霉组和黑曲霉组的DPPH自由基清除能力与还原能力则相对酿酒酵母组和红酵母NY5组更有效。造成这种情况的可能原因是，乳球菌组中的总酚含量最高，而2种曲霉组产生的总酚含量也相对多于2种酵母菌组。因此，与其他4种菌株相比，冻干无花果经乳球菌发酵后的提取物的抗氧化活性更高。与Mousavi等[32]的研究类似，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)发酵石榴汁后的DPPH清除力显著增加，抗氧化能力(A700)也显著增强。这主要归因于乳酸菌发酵后酚类和黄酮类化合物[8,13,16,27]的含量和活性明显增加。

米曲霉组、黑曲霉组、酿酒酵母组、红酵母NY5组、乳球菌组的LC-MS结果均检测出相同的47种化合物，对照组中也检测出除匙羹藤酸I外的其余46种化合物。与对照组相比，所有实验组的提取物中多酚和黄酮类成分的峰面积变大。说明冻干无花果经受试菌株发酵后的提取物中多酚和黄酮类化合物的总含量增加。将所有受试组中经LC-MS检测出的多酚和黄酮类物质进行PCA分析，米曲霉组、黑曲霉组、酿酒酵母组、红酵母NY5组和乳球菌组进行了明显区分，表明不同种类的微生物导致每个样品中多酚和黄酮类化合物特征不同。用米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母和乳球菌发酵的样品位于阳性PC1区域，红酵母NY5和对照组位于阴性PC1区域，表明红酵母NY5无法形成复杂的多酚和黄酮类物质。在本研究中，从化合物的含量来看，经米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、红酵母NY5和乳球菌发酵的样品中的主要化合物完全不同。本研究中，米曲霉和黑曲霉组中，提取物的主要化合物是异沙糖苷、2,6-二甲氧基-4-甲基苯酚、5-甲氧基补骨脂素、4′-羟基-3,5,8,3′-四甲氧基-7-异戊氧基黄酮、芦丁、丁香酸、5-羟基-7,2′,3′,4′,5′-五甲氧基黄酮、3,5,6-三甲氧基-3′,4′-亚甲基二氧基呋喃黄酮。槲皮素3-O-6′-丙二酰基-葡糖苷、4-正庚基苯酚、4-正己基苯酚、5,5′-二羟基-3,6,7,2′,4′-五甲氧基黄酮和5′-葡糖苷则在酿酒酵母组和红酵母NY5组的样品中含量较多。经乳球菌发酵后，提取物中的主要化合物有对羟基苯甲醇、7-异戊烯氧基-3′-羟基-4′-甲氧基异黄酮、黄芪素、5,7,3′,5′-四羟基-3,6,8,4′-四甲氧基黄酮和3′-葡糖苷。综上说明，乳酸菌和曲霉在提高无花果中多酚和黄酮类化合物的含量和抗氧化活性比酵母菌更有效。

4 结 论

选择微生物固态发酵的方式来提高冻干无花果中的总多酚和总黄酮类物质含量以及抗氧化活性是可行的，为利用无花果开发功能性食品或配料提供依据和数据参考。