Wnt/β-catenin通路与NF-κB通路的交叉调控对间充质干细胞分化的影响

孙佳瑶，宗 斌，谢雨桐，徐全臣

Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路都具有高度保守性，参与调控多种生物学进程。近年来研究发现，二者之间存在错综复杂的调控关系，不仅对炎症、免疫、肿瘤等的发生发展产生影响，在组织再生领域也影响深远。间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)具有多向分化潜能和免疫调节性，能够参与和促进组织的修复，是组织工程“三要素”之一。对于因炎症、免疫失调、肿瘤等病理状况导致的机体稳态失衡及组织破坏，干细胞疗法被视为一种具有广泛应用前景的治疗手段。Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路之间的交叉调控，能够影响间充质干细胞的多向分化，进而影响组织的再生和修复。

1 Wnt/β-catenin 信号通路

Wnt/β-catenin信号通路又称经典Wnt信号通路，在正常成熟细胞中处于沉默状态。人类基因组中含有19个Wnt基因[1]，相关Wnt蛋白在结构和功能上高度保守，并且在某些细胞类型中选择性表达。在沉默状态下，细胞质中的β-catenin与结肠腺瘤性息肉病蛋白(adenoma polyposis coli，APC)、轴蛋白(Axin)、糖原合成激酶-3β(glycogen synthase kinase 3β，GSK-3β)以及酪蛋白激酶1(casein kinase1，CK1)所形成的降解复合体相结合，促使β-catenin磷酸化泛素化降解。当细胞外Wnt蛋白与细胞膜表面卷曲蛋白(Frizzled，FZD)受体或低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6(low-density lipoprotein receptor-related protein 5/6，LRP5/6)结合时，即可激活该通路，并激活细胞质内的蓬乱蛋白 (dishevelled，Dsh/Dvl)，使降解复合体失活，游离的β-catenin不再泛素化和降解，而是发生核转位，与T细胞因子(T cell factor，TCF)/淋巴样增强因子(lymphoid enhancer factor，LEF)家族结合，从而促进靶基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路在炎症、免疫调节和肿瘤的发生发展等过程中发挥了重要作用。目前研究认为该通路在调控MSCs多向分化方面至关重要[2-3]。研究表明，Wnt/β-catenin信号通路还可与其他通路产生交叉影响，如NF-κB、Smad-3、Notch、HIF-1α等，使其功能得到扩展[4-7]。

2 NF-κB信号通路

NF-κB家族主要包括5个成员，NF-κB1(p105/p50)、NF-κB2(p100/p52)、RelA(p65)、RelB和c-Rel。所有成员的N端都含有Rel同源结构域：核定位信号序列、二聚化区域、DNA 结合区，RelA(p65)、RelB、c-Rel的C末端含有促进基因转录的反式激活域。NF-κB的各成员可组成多种二聚体，但只有含有RelA(p65)、Rel B、c-Rel的异源二聚体具有生物活性。在沉默状态下，NF-κB在细胞质内与其抑制蛋白(inhibitor of NF-κB，IκB)相结合，不具备转录活性。该通路可由诸多外界刺激如细胞因子、生长因子、微生物产物、应激诱导以及T细胞受体的参与等激活，这些刺激因子与细胞膜上的肿瘤坏死因子受体超家族和白细胞介素-1受体/Toll样受体(Toll-like receptor， TLR)超家族，以及T细胞受体或细胞内介质相结合，激活 IκB激酶(IκB kinase，IKK)复合物，后者磷酸化IκB，随后IκB发生泛素化并降解，NF-κB二聚体释放，激活后移位至细胞核，调节目的基因的表达。目前证据表明NF-κB信号通路在调节MSCs的多向分化方面具有双向性[8]，据报道该通路对骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的骨向分化、成软骨分化及肌成纤维细胞分化具有负向调控作用[9-11]，但也有人提出TNF-α能够通过激活NF-κB通路促进BMSCs的成骨分化[12]。

3 Wnt/β-catenin通路与NF-κB通路的相互作用

Wnt/β-catenin通路与NF-κB通路之间的相互交叉影响使二者的功能得到扩展，并形成了一个更加复杂的调控网络。Wnt/β-catenin通路通过与NF-κB通路的相互作用来调节炎症和免疫反应；反之，NF-κB通路也影响Wnt/β-catenin通路的活性。根据细胞或组织环境的不同，目前已观察到二者之间存在正向及负向的双向交叉调控。这两条通路之间的相互作用不仅可以显著影响炎症、免疫反应和癌症的进展，还被证实与MSCs多向分化密切相关。因此了解二者交叉调控的分子基础有助于阐明MSCs在免疫炎症反应及肿瘤等相关疾病发挥治疗作用的病理生理机制，并有助于进一步针对相关靶点开发更具体更有效的治疗方案。

3.1 Wnt/β-catenin通路对NF-κB通路的调控

Deng等[13]在对人结肠和乳腺肿瘤的研究中，首次发现Wnt/β-catenin通路对NF-κB通路的负向调控。该研究发现，激活的β-catenin可与p65、p50形成复合物，抑制NF-κB通路与DNA的结合、反式激活活性。激活的β-catenin可使NF-κB通路的靶基因FAS表达降低，因此可能与FAS介导的肿瘤发生有关。在乳腺和结肠肿瘤细胞中，观察到激活的β-catenin对NF-κB通路具有抑制作用[14]。除此之外，研究发现肝胆管上皮细胞内的β-catenin能够抑制NF-κB通路的活性；肝胆管上皮细胞内β-catenin基因敲除后，p65核转位明显增强，受损肝脏出现明显炎症及纤维化、肝再生延迟[15]。除肿瘤细胞外，在软骨细胞、成纤维细胞、上皮细胞、成骨细胞和肝细胞等非肿瘤细胞内，也发现了β-catenin对NF-κB通路的抑制作用[16]。Wnt3a抑制剂不仅可抑制Wnt/β-catenin通路的激活，同时降低NF-κB的核转位和活性，下调大鼠脊髓NMDA受体的表达，减轻瑞芬太尼引起的痛觉减退[17]。

Wnt/β-catenin通路也能够正向调控NF-κB通路。在人星形胶质细胞内，β-catenin敲除后，NF-κB的活性降低了70%[18]。Zhou等[19]也发现，在成纤维细胞中的β-catenin敲除后，缺血肾脏中FAS配体的表达受到抑制，说明成纤维细胞特异性的β-catenin可通过NF-κB通路保护肾脏，抑制其细胞凋亡。过表达的β-catenin及相关的Wnt家族蛋白可启动Wnt/β-catenin通路，通过促进IκB-α的降解，反式激活NF-κB，但该过程并未影响IKK活性[20]。在血管平滑肌细胞中，Wnt 1可通过激活β-catenin/ TCF4介导的β-转导重复相容蛋白(β-transducin repeat-containing protein， β-TrCP)，间接增强NF-κB通路活性[21]。在人结肠癌细胞中也发现，β-catenin/ TCF4复合体呈时间剂量依赖性转录激活RelA启动子，上调RelA的表达，启动NF-κB通路，进而调控有关细胞增殖和细胞死亡的靶基因，影响结直肠癌的进展[22]。此外，还有研究发现β-catenin-TCF/LEF复合物可与NF-κB靶基因的启动子结合，例如C反应蛋白和基质金属蛋白酶13，与NF-κB共同上调NF-κB靶基因的转录[23]。以上证据表明Wnt/β-catenin通路各组分可通过多种途径间接正向调控NF-κB通路。

3.2 NF-κB通路对Wnt/β-catenin通路的调控

目前研究证实，NF-κB可通过调节影响β-catenin活性和稳定性的靶基因的表达，间接调控Wnt/β-catenin通路。Chang等[24]发现NF-κB可通过诱导E3泛素蛋白连接酶SMAD泛素化调节因子1(SMAD ubiquitination regulatory factor 1， Smurf1)和Smurf2，从而促进β-catenin降解，抑制MSCs的成骨分化能力。Pei等[25]在类固醇相关的股骨头坏死小鼠模型中发现TLR4/NF-κB过度激活后，可能在早期通过影响DKK1和GSK3β的活性，抑制Wnt/β-catenin通路，进而影响其级联靶基因如成骨、血管生成和脂肪细胞的分化。

NF-κB通路也能够正向调控Wnt/β-catenin通路的表达。NF-κB通路激活后，Wnt1、Wnt3a和Wnt5a等Wnt相关蛋白表达升高，表明Wnt/β-catenin信号通路被激活[26]。抑制NF-κB，能够减弱GM-CSF和TSLP的启动子活性，进而降低β-catenin及其下游基因的表达，抑制乳腺癌的发展[27]。在小鼠模型的去分化诱导肠肿瘤发生研究中发现，NF-κB作为β-catenin/ TCF转录辅助因子，激活后可增强后者信号的表达强度，并诱导具有肿瘤早期特性的非干细胞去分化[28]。近年研究还发现，小白菊内酯对NF-κB的抑制作用可下调dickkopf相关蛋白1(DKK1 dickkopf-related protein 1)从而激活Axin2和β-catenin，也提示NF-κB通路对Wnt/β-catenin信号通路具有调控作用[29]。此外，RelA/p50二聚体通过CBP与靶基因的β-catenin/TCF转录复合物结合，能够增强部分干细胞特征性基因的活性，如Lgr5、Asc1和Sox9等[16]。

3.3 Wnt/β-catenin通路与NF-κB通路的交叉位点

3.3.1 GSK-3β GSK-3β是Wnt/β-catenin信号通路重要的调节信号，GSK-3β磷酸化可阻止β-catenin的降解，使后者得以积聚转入核内，从而促进靶基因的表达。研究表明，GSK-3β能够通过调节β-catenin和p65的核转位来介导β-catenin和NF-κB信号转导[30]。GSK-3β的抑制剂IMX可以减弱IKKβ的磷酸化，抑制NF-κB p65在核内的积聚，阻止神经元的凋亡[31]。Su等[32]发现GSK-3β的抑制剂还可以通过抑制TLR/MyD88通路，进而下调NF-κB p65的磷酸化，减轻氧化应激引起的损伤和下游炎症因子的产生。研究表明GSK-3β抑制剂氯化锂不仅能够激活BMSCs中Wnt/β-catenin信号通路增强其成骨及成脂分化能力[33]；还可以绕过IKK上调IκB-α的表达促进p65/RelA磷酸化，激活NF-κB通路，驱动衰老相关分泌表型基因的表达，参与调控细胞凋亡[34]。但也有学者提出在激活的T细胞内，GSK-3β过表达后，能够阻碍IκB-α的降解；而抑制GSK-3β则使NF-κB靶基因表达下调[35]。反之，磷酸化的NF-κB p65能够诱导肝细胞中GSK-3β的磷酸化，促进肝细胞增殖，诱导肝细胞癌的发生[36]。以上证据均表明GSK-3β是两条通路交叉调控的关键靶点。

3.3.2 Wnt3a 前文已述，抑制Wnt3a的表达可降低NF-κB的核转位和活性，下调大鼠脊髓中NMDA受体的表达，有助于减轻瑞芬太尼引起的痛觉减退症状[17]，但在该过程中Wnt3a对NF-κB通路的具体调节机制仍未知。在脂多糖诱导的炎症反应中，单核细胞内Wnt3a-Dvl3激活可增强GSK-3β磷酸化，使β-catenin积聚发生核移位，靶基因表达增强，减轻炎症反应。进一步研究还发现，抑制Wnt3a-Dvl3的表达可显著增强NF-κB的活性，而Dvl3或β-catenin过表达则可消除上述影响；在使用NF-κB抑制剂后，炎症相关因子表达明显减弱。表明Wnt3a-Dv13/β-catenin轴可通过下调脂多糖刺激单核细胞中NF-κB的活性来抑制炎症反应[37]。有学者提出，Wnt3a可以通过抑制GSK-3β-NF-κB的相互作用下调衰老相关分泌表型基因的表达，抑制MSCs衰老并促进其增殖[38]。但在MSCs多向分化方面，对于Wnt3a所参与的两条通路的交叉调控目前尚未有相关研究。

3.3.3 DKK1 DKK1是Wnt/β-catenin信号通路的抑制剂，通过结合和诱导LRP6内化来阻止Wnt信号的传递。研究发现DKK1可剂量依赖性地下调核NF-κB水平，减弱内毒素诱导的炎症反应[39]。Zhang等[29]也发现，小白菊内酯可通过抑制NF-κB活性，下调DKK1的水平，增强Axin2和β-catenin表达，使Wnt/β-catenin通路的活性增强，增强牙周膜干细胞的骨向分化能力。此外还有报道，TNF-α可通过激活NF-κB通路下调miR-335-5P的表达水平，从而抑制DKK1的活性，进而刺激Wnt/β-catenin通路的活性，影响成骨细胞的成骨能力[40]。

3.3.4 IKK IKKβ是IKK亚基之一，不仅可以调控IκB的磷酸化，也可以促进β-catenin磷酸化，为β-TrCP介导的泛素化而准备，抑制Wnt/β-catenin信号通路活性，促进MSCs的脂向分化能力、抑制其骨向分化能力[41]。Xu等[42]发现小鼠牙周炎牙合创伤模型中，IκB和p65磷酸化增强，激活NF-κB通路，同时也抑制β-catenin的表达，下调成骨相关基因，体内成骨明显受到抑制；但IKK抑制剂处理后，NF-κB表达受到抑制，β-catenin表达则增强，成骨细胞成骨能力明显增强。表明IKK是两条信号通路之间相互作用的重要交叉位点。在对炎症微环境下的BMSCs的研究中也发现了相似的现象[24]。炎症因子通过激活IKK-NF-κB，促进了β-catenin的泛素化降解，抑制MSCs的成骨能力；但IKK抑制剂成功逆转该现象，上调了β-catenin的表达，恢复了MSCs因炎症刺激而受损的成骨能力。

4 Wnt/β-catenin与NF-κB的交互调控对间充质干细胞分化及组织再生的影响

MSCs是一种具有自我更新能力和多向分化能力的基质细胞。它可以从多种组织中分离出来，如乳腺、脐带、子宫内膜息肉、骨髓、脂肪组织、牙龈、牙周膜、肺组织等，因其来源丰富及其易获得性，被认为是最适用于实验及临床研究的干细胞。根据其来源组织，MSCs可发挥具有一定组织特异性的再生能力，参与因炎症、免疫失调、肿瘤等原因引起的受损组织的修复与再生。Wnt/β-catenin与NF-κB的相互作用已被证实能够参与调控MSCs的多向分化，成为利用干细胞疗法获得组织再生修复的重要靶点。

4.1 骨髓间充质干细胞

BMSCs是目前研究最多的MSCs。目前认为Wnt/β-catenin信号通路与MSCs成骨分化密切相关。研究发现在炎症微环境中，TNF-α通过IKK-NF-κB通路诱导Smurf1和Smurf2的表达，促进β-catenin的泛素化和降解，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路表达，削弱MSCs的成骨分化；但IKK抑制剂的应用能够逆反上述现象，促进BMSCs的成骨能力[24]。这表明靶向抑制IKK-NF-κB，不仅能够减轻NF-κB通路介导的炎症反应，还能够恢复因炎症而受损的BMSCs再生能力。目前证据表明IKKβ是肥胖、炎症与代谢紊乱之间的关键分子[43]。研究发现IKKβ也具有β-catenin激酶作用，能够通过调控Wnt/β-catenin信号通路间接调节BMSCs的多向分化[41]。IKKβ可以通过促进β-catenin个别氨基酸位点的磷酸化，为β-TrCP介导的β-catenin泛素化做准备，促进BMSCs的成脂分化能力。而IKKβ缺陷的BMSCs，其成骨能力明显增强，成脂能力减弱。动物实验也证实BMSCs中IKKβ的缺失增加了骨皮质厚度，这对于肥胖引起的骨密度降低具有重要的治疗意义。此外，有学者发现，TNF-α可通过刺激NF-κB信号通路活性，上调miR-150-3p的表达，进而调节β-catenin的表达水平，抑制人BMSCs的成骨能力[44]。这对于骨关节炎、类风湿性关节炎等炎症状态下的骨相关疾病的干细胞治疗意义重大。

4.2 牙周膜干细胞

在炎症微环境下，Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路能够调节牙周骨质代谢，影响牙周炎症的发生，在牙周膜干细胞成骨再生方面具有重要意义。牙周炎患者的牙周组织处于炎症微环境下，牙周膜干细胞的成骨能力受到抑制。在牙周炎患者的牙周膜干细胞中，NF-κB信号通路可被直接激活，也可以通过抑制PI3K的活性间接激活，进而阻断GSK-3β的磷酸化，导致细胞核中p65和β-catenin的表达水平升高，使牙周炎患者的牙槽骨形成受到抑制[30]。但这与健康牙周膜干细胞中的结果并不一致，说明两条通路的交叉调控还受到炎症微环境的影响。此外，还有研究发现在根尖周炎的根尖组织中，两条通路均被激活，随之的动物实验进一步证实，NF-κB抑制剂的应用阻断了Wnt3a/β-catenin信号通路的激活，使内毒素刺激后的牙周膜干细胞的炎症反应显著减轻[4]，有助于根尖周炎炎症的消退、恢复牙周膜干细胞的再生潜能，促进根尖周受损组织修复。

4.3 肺间充质干细胞

在人肺间充质干细胞中，IL-1β可以通过NF-κB信号通路增强miR-433表达，后者可抑制DKK1活性，促进β-catenin的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，刺激肺间充质干细胞血管再生能力，有助于肺损伤后的组织修复[45]。还有研究发现，TNF-α在激活NF-κB信号促进肺间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的同时，可上调β-catenin的表达。进一步体内研究也证实抑制NF-κB信号可下调β-catenin表达，减弱肺间充质干细胞向肌成纤维细胞的分化，并缓解博莱霉素诱导的肺纤维化病变[46]。虽然具体机制仍有待探索，但目前研究表明NF-κB与Wnt/β-catenin信号通路的交叉调控有希望成为肺纤维化治疗的新的研究方向。

4.4 脂肪干细胞

前文已述，IKKβ目前被认为是肥胖、炎症与代谢紊乱之间的关键调节分子[43]。研究表明肥胖导致的机体慢性轻度炎症是2型糖尿病和动脉粥样硬化发展的主要因素，同时临床数据也表明，肥胖受试者腹部脂肪中IKKβ的总蛋白及磷酸化蛋白水平显著升高，且与体重指数明显相关。Sui等[41]在体外实验发现，过表达的IKKβ可通过促进β-catenin的磷酸化和泛素化，抑制Wnt/β-catenin通路活性，增强脂肪干细胞成脂分化潜能，抑制其成骨能力。靶向抑制IKKβ可能不仅有助于减轻炎症反应，还有助于抑制脂肪生成，这对于肥胖患者相关疾病的治疗意义重大。

4.5 乳腺干细胞

在乳腺组织中，NF-κB通路的激活能够增强miRNA-31的表达，后者通过靶向调控Axin1、GSK-3β和DKK1的表达，激活Wnt/β-catenin信号通路，上调β-catenin的活性，参与维持多能乳腺干细胞的自我更新及增殖，并抑制其向腔细胞或腺泡细胞的分化[47]。在乳腺干细胞自我更新和分化之间取得平衡有助于维持乳腺的组织动态平衡，这对乳腺发育和乳腺癌个体发育至关重要。

此外，除上述MSCs外，在牙髓干细胞内也发现，Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路共同参与干细胞的多向分化[48]，但关于二者之间交叉调控的具体机制仍有待探索。

5 总 结

本文就近年来对Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路之间的相互作用研究进行了总结，并针对二者的交叉调控在参与MSCs多向分化有关方面进行了描述。在利用MSCs获得组织再生时，我们可充分借助Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路之间的交叉调控，以最大限度地利用MSCs的多向分化，获得更加理想的组织再生与修复；还可以借助相关信号通路的辅助因子，或直接作用于靶基因，避开二者的交叉作用位点，以规避负反馈影响[16]。总之，了解Wnt/β-catenin信号通路与NF-κB信号通路之间交叉调控具体分子机制有助于开发针对具体靶点的药物，对于利用MSCs的多向分化获得组织再生、修复受损组织具有重要的研究价值和临床意义，对今后相关的干细胞研究工作也具有重要的指导作用。