梓醇-川芎嗪方对AD模型小鼠学习记忆行为及炎性因子的影响

孟胜喜，陈慧泽，邓楚珺，孟泽宇

(1. 上海交通大学医学院附属第六人民医院，上海 200233；2. 黑龙江中医药大学第二临床医学院，黑龙江 哈尔滨 150040)

据估计，目前全世界有5 000万人患有痴呆症[1]，其中阿尔茨海默病(AD)占60%～80%，显著增加了照顾负担和经济负担[2-4]。随着老龄化人口的快速增长，AD的患病率呈逐年上升趋势，世界卫生组织宣布AD已经成为亟待解决的全球公共卫生问题。AD的特点是记忆力和认知能力进行性下降，最终影响到其日常活动能力和和自主功能[5]。截至目前,尚无AD治疗特效药。前期课题组研究发现，梓醇-川芎嗪方可以有效改善AD模型小鼠的认知障碍[6]。目前研究证实，神经炎症伴随着AD的发生与发展[7]。为了进一步探讨梓醇-川芎嗪方对APP/PS1小鼠学习记忆行为及炎性因子的影响，故开展本实验。

1 实验材料与方法

1.1动物 3月龄SPF级雄性APPswe/PS1ΔE9双转基因小鼠50只，3月龄C57BL/6J野生型雄性小鼠10只，体重(23±3)g，均购自南京大学模式动物研究所，动物生产许可证号：SCXK-(苏)2018-0008。全部小鼠在上海吉凯基因化学技术有限公司动物房单笼预饲养2周，光照/黑暗：12 h/12 h，随意饮水和进食，温度(22±2)℃,相对湿度(60±5)%,12 h光照。该实验经上海市第六人民医院动物伦理福利委员会批准(DWLL2022-0453)。

1.2药物 梓醇-川芎嗪方由梓醇4.274 mg和川芎嗪1.554 mg组成。梓醇CAS 编号：2415-24-9，分子式：C15H22O10，分子量为362.33，纯度≥98.0%,上海沪峥生物科技有限公司提供，批号：DSTDZ000502。川芎嗪CAS 编号：1124-11-4，分子式：C8H12N2，分子量为136.19，纯度≥98.0%，上海沪峥生物科技有限公司提供，批号：DST200602-032。盐酸多奈哌齐(安理申)，卫材(中国)药业有限公司，国药准字H20050978，批号：1705080，规格：5 mg/片。

1.3仪器与试剂 实验Morris水迷宫(上海吉量软件科技有限公司生产，型号：JLBehv-MWMG-1)；全自动化学发光仪(Tanon-6100)。白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-10(IL-10)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、β淀粉样蛋白(Aβ)、Tau蛋白、磷酸化Tau蛋白(p-Tau)ELISA 试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)。

1.4实验方法 将50只SPF级APPswe/PS1ΔE9双转基因雄性小鼠随机分为5组，每组10只。将10只同月龄C57BL/6J野生型雄性小鼠作为正常组。依据人和动物体表面积折算系数换算[8]给药量，梓醇-川芎嗪方低、中、高剂量组分别给予25 mg/kg、50 mg/kg、100 mg/kg梓醇-川芎嗪方灌胃，安理申组给予安理申溶液5 mg/kg灌胃，正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃，均每天1次，连续灌胃8周。

1.5检测指标及方法

1.5.1小鼠空间学习记忆能力 干预7周后，采用Morris水迷宫实验评估小鼠学习记忆能力。Morris水迷宫有4个象限，在第3象限中央置平台，保持水温22 ℃左右，接入图像采集系统。实验前1 d对小鼠进行适应性训练。池内注水，水位要高于平台1 cm，并倒入奶粉隐藏平台，于第1，2，4象限水池中点随机面壁放入小鼠，记录小鼠找到并爬上平台的时间，即逃避潜伏期，连续记录5 d。第6天，撤掉平台，第1象限中点面壁放入小鼠，记录120 s内小鼠穿越原平台次数。

1.5.2小鼠对新物体的偏好指数 采用新物体识别测试方法进行，该测试分为适应期、训练期和测试期三部分[9]。在适应期里，将每只小鼠置于箱内10 min；在训练期里，将A1、A2相同的物体放入到以上的箱内，让小鼠在箱子里面活动10 min；在测试期里，将A2换成 B1(A、B两物体是相似的)，然后分别测试1 h、24 h小鼠对新旧物体的探索时间，计算偏好指数。小鼠在在物体A1探索时间，即F，在物体A2/B2探索时间为N，偏好指数=(N-F)/(N+F)×100%。

1.5.3血清和脑组织海马区相关蛋白及炎症因子水平 在灌胃结束的次日，将全部小鼠用10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉后，从眼球取血，低温离心机4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取其上清，置于4 ℃冰箱保存；同时分离出脑组织海马区，置于-80 ℃冰箱保存，检测时4 ℃超声匀浆为0.01%的组织悬液。各指标检测严格按照酶联免疫吸附试验试剂盒步骤进行。

2 结 果

2.1各组小鼠逃避潜伏期和跨越平台次数比较与正常组比较，模型组小鼠第1～5天的逃避潜伏期均明显延长(P均<0.05)，穿越原平台次数明显减少(P<0.05)。第1天，梓醇-川芎嗪方高剂量组小鼠的逃避潜伏期明显短于模型组(P<0.05)；第2天，梓醇-川芎嗪方中、高剂量组及安理申组小鼠的逃避潜伏期均明显短于模型组(P均<0.05)；第3～5天，梓醇-川芎嗪方各组和安理申组小鼠的逃避潜伏期均明显短于模型组(P均<0.05)；梓醇-川芎嗪方高剂量组第3天的逃避潜伏期和梓醇-川芎嗪方中、高剂量组及安理申组第4天、第5天的逃避潜伏期均明显短于梓醇-川芎嗪方低剂量组(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方高剂量组第4天、第5天的逃避潜伏期均明显短于川芎嗪方中剂量组和安理申组(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各组和安理申组小鼠穿越原平台次数均明显多于模型组(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高剂量组明显多于梓醇-川芎嗪方低、中剂量组及安理申组(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中剂量组及安理申组均明显多于梓醇-川芎嗪方低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠Morris水迷宫实验逃避潜伏期和跨越平台次数比较

2.2各组小鼠对新物体的偏好指数比较 模型组1 h、24 h对新物体的偏好指数均明显低于正常组(P均<0.05)；梓醇-川芎嗪方各组和安理申组1h、24h对新物体的偏好指数均明显高于模型组(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高剂量组明显高于梓醇-川芎嗪方低、中剂量组及安理申组(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中剂量组及安理申组均明显高于梓醇-川芎嗪方低剂量组(P均<0.05)。见表2。

表2 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠对新物体的偏好指数比较(±s，%)

2.3各组小鼠血清和脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比较 模型组小鼠血清和脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量均明显高于正常组(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各组和安理申组小鼠血清和脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量均明显低于模型组(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高剂量组明显低于梓醇-川芎嗪方低、中剂量组及安理申组(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中剂量组及安理申组均明显低于梓醇-川芎嗪方低剂量组(P均<0.05)。见表3及表4。

表3 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠血清Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比较

表4 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量比较

2.4各组小鼠血清和脑组织海马区炎症相关因子水平比较 模型组小鼠血清和脑组织海马区IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平均明显高于正常组(P均<0.05)。梓醇-川芎嗪方各组和安理申组小鼠血清和脑组织海马区IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平均明显低于模型组(P均<0.05)，且梓醇-川芎嗪方高剂量组明显低于梓醇-川芎嗪方低、中剂量组及安理申组(P均<0.05)，梓醇-川芎嗪方中剂量组及安理申组均明显低于梓醇-川芎嗪方低剂量组(P均<0.05)。见表5及表6。

表5 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠血清IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

表6 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠脑组织海马区IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平比较

3 讨 论

梓醇-川芎嗪方来源于本课题组长期临床经验总结出来治疗AD的有效方剂—恒清Ⅱ号方[10-15]，该方由熟地黄15 g、川芎10 g组成，专利号为201910371018.5。梓醇是从地黄中提取的环烯醚萜类化合物，其在熟地黄中的平均含量为0.267%；川芎嗪为川芎中的主要生物碱，川芎中川芎嗪含量为0.152 3%。梓醇可以通过抑制神经元凋亡、抗氧化、促血管新生、促神经营养因子等途径起到防治AD的作用[16]，川芎嗪具有抗炎、抗氧化、抗血小板作用[17]。本课题组前期研究发现，梓醇-川芎嗪方改善AD小鼠认知障碍的效果优于梓醇或川芎嗪单用及安理申干预[6]。本课题组为梓醇-川芎嗪方申请了国家专利，且已经获得授权，专利号：ZL 202011556436.0，授权公告号：CN 112336738 B。

神经炎症是导致神经细胞进行性变性和死亡的重要机制，是引起AD发生发展的重要原因之一，调控神经炎症可能成为AD治疗的突破点和未来的治疗手段[18-19]。AD的发病与Aβ、Tau和p-Tau的大量沉积有密切关系，而这些蛋白能引发小胶质细胞表型的活化且促进炎性因子的表达，因此认为AD的发病与炎症密切相关[20]。故本实验从神经炎症角度探讨了梓醇-川芎嗪方对AD的影响。

本研究中，与模型组比较，梓醇-川芎嗪方各组APPswe/PS1ΔE9双转基因雄性小鼠的逃避潜伏期更短，小鼠穿越原平台次数增多，小鼠的1 h、24 h对新物体的偏好指数增高，血清和脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白含量及IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平降低，且其作用与剂量呈正相关。证实梓醇-川芎嗪方可以呈剂量依赖性改善APPswe/PS1ΔE9小鼠的学习记忆行为，且高剂量作用更明显，机制可能与降低血清和脑组织海马区Aβ、Tau、p-Tau蛋白及炎性因子IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α水平，抑制神经炎症有关，进一步为梓醇-川芎嗪方的临床应用提供了理论依据。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。