人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测1)

马新智 卢宝慧 王若谷 陈长卿 张艳敬 高洁

(吉林农业大学，长春，130118)

冯志伟 侯万鹏 孙国刚 李公启

(吉林参王植保科技有限公司) (集安市人参研究所)

In order to clarify the resistance of ginseng Botrytis cinerea strains to mefentrifluconazole, the sensitivity of B. cinerea to mefentrifluconazole was determined by mycelial growth rate method, and fungicide-resistance of B. cinerea to mefentrifluconazole was monitored with minimum inhibitory concentration method. The range of EC50 values of mefentrifluconazolea gainst the tested B. cinerea strains was from 0.008 4 to 2.795 8 mg/L, and the sensitivity frequency distribution showed a continuous unimodal curve, which was in line with the normal distribution by K-S method. There was no resistant population with significantly decreased sensitivity, and its average EC50 value of 0.174 4 mg/L can be used as the sensitive baseline of B. cinerea to mefentrifluconazole. There were significant differences in the sensitivity of B. cinerea strains from different geographical regions and different years to mefentrifluconazole. Most of the tested strains of B.cinerea were sensitive or low resistantto mefentrifluconazole, only a small number of medium and high resistant strains were found in Fusong County and Ji’an City of Jilin Province, and the resistance frequency was all less than 3.7%.

由灰葡萄孢(Botrytiscinerea)引起的灰霉病是人参生产上的最重要的病害之一，通常发病株率为15%～30%，严重地块超过50%，严重影响了人参的产量和品质[1]。灰葡萄孢寄主范围广泛，具有变异频率高、再侵染频繁、易产生抗药性等特点，属于高抗药性风险的致病菌之一[2]。化学药剂是防治灰霉病的重要手段，但化学药剂的长期使用易导致灰霉病菌产生抗药性等问题。抗药性一旦产生病菌对药剂的敏感性下降，防治效果随之降低。检测病原菌抗药性产生是植物病害防治的重要内容[3]。已有研究表明，灰葡萄孢对腐霉利、嘧霉胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、异菌脲、多菌灵、乙霉威等已产生不同程度的抗药性[4-11]。

氯氟醚菌唑是由巴斯夫公司2016年开发的异丙醇三唑类杀菌剂，陆续在北美洲、欧洲和我国获得登记使用，用于防治多种作物的叶斑病和灰霉病等[12-16]。Li et al.[17]已建立了来自草莓、芸豆、番茄和黄瓜上的灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感基线，氯氟醚菌唑处理黄瓜灰葡萄孢后可导致菌丝分支增加，麦角甾醇含量降低，细胞膜通透性发生变化，在离体情况下，200 mg/L氯氟醚菌唑对黄瓜灰霉病的预防效果可达100%，治疗效果为72.7%，防治效果较好，且证实氯氟醚菌唑与戊唑醇、苯醚甲环唑、腈菌唑、己唑醇、三唑酮、氟哇唑、氯啶菌酯之间无交互抗性。

关于人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑抗性情况未见报道。因此，本研究测定了来自东北三省的148株人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，建立了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线，比较了不同来源、不同年份的菌株敏感性差异监测了各个地区和不同年份获得的人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，以期明确人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病科学使用和灰葡萄孢病菌的抗药性风险评估提供科学依据。

1 材料与方法

供试材料：2017—2019年从人参产区田间发生灰霉病的植株分离的148株人参灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，用于敏感基线的建立；2020—2021年分离获得的246株灰葡萄孢病菌用于抗药性监测，所有菌株均经过柯赫氏法则验证对人参有致病性。滤纸片法-20 ℃保存于吉林农业大学植物病害综合治理实验室，使用前在PDA平板培养基上活化。供试药剂为400 g/L氯氟醚菌唑悬浮剂由巴斯夫欧洲公司提供。

含药培养基的制备：将400 g/L的氯氟醚菌唑悬浮剂配成10 000 mg/L母液，置于4 ℃冰箱中备用。使用时用蒸馏水稀释母液，按设置浓度加入到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，充分混匀，分别制成质量浓度为1 000、100、10、1、0.1、0.01、0.001 mg/L的含药平板[18]。

药剂敏感性测定：参考Yin et al.[19]的方法进行测定。25 ℃条件下，待测菌株在PDA平板上培养120 h，用无菌打孔器自菌落边缘打取直径8 mm的菌饼，菌丝面朝下接种于含药PDA平板的中心。每个浓度重复3次，以不加药的PDA平板作为对照。25 ℃下培养120 h，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算不同浓度的药剂对菌丝的生长抑制率。

菌丝生长抑制率=[(对照菌落直径-处理菌落直径)/(对照菌落直径-菌饼直径)]×100%。

人参灰葡萄孢病菌田间抗药性监测：将2020—2021年分离获得的246株灰葡萄菌株25 ℃ PDA上活化培养后，置于敏感基线值的5、10、100倍浓度的含药PDA培养基上，以含等量无菌水的PDA培养基作为空白对照，均设3次重复，在25 ℃恒温、无光照、30% RH条件下培养5 d后，测量菌丝生长情况，参照推荐的标准[20-21]划分抗性类型，并计算其抗性频率。抗性水平划分：所有菌株在等量无菌水的PDA培养基均可正常生长，在所有浓度的含药PDA培养基上均不能生长的菌株为敏感菌株；在5倍敏感基线值浓度可以生长，10倍浓度不能生长的的菌株为低抗菌株；在5倍、10倍浓度均可以生长，100倍浓度不能生长的菌株为中抗菌株；在所有浓度均生长的为高抗菌株。抗性频率=(抗性菌株数/总菌株数)×100%。

数据处理：采用SPSS 16.0和DPS 16.0进行数据处理。根据野生敏感型病原群体对药剂敏感性分布为正态分布的原理，确认病原菌群体EC50敏感性频率分布是否呈正态分布或连续的单峰曲线，如果呈正态分布或连续的单峰曲线，可将其群体EC50均值作为病原菌对药剂的敏感基线[22]。采用SPSS 16.0软件中的Duncan氏新复极差法对不同地区、不同年份的平均EC50值进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感基线的建立

由表1可知，氯氟醚菌唑对来自东北地区的148株人参灰葡萄孢病菌的EC50值分布在0.008 4～2.795 8 mg/L，平均值为0.174 4 mg/L，所检测的菌株对该药剂具有较高的敏感性，未发现抗药性亚群体。但最大值为最小值的332倍，EC50值跨度范围比较大，表明群体内个体间对氯氟醚菌唑的敏感性差异较大。EC50敏感性频率分布呈现连续性单峰曲线，通过DPS中的K-S正态检验得到P=0.12>0.05，说明人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性频率符合正态分布，按照野生型病原群体对药剂的敏感性呈正态分布的原理，本研究中148株灰葡萄孢病菌的EC50平均值0.174 4 mg/L可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线。

表1 148株人参灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感性频率分布

2.2 不同地区来源的灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性水平

由表2可知，不同地区来源的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在一定的差异(P<0.05)；较敏感的是来自吉林省的抚松县和靖宇县，黑龙江省的尚志县及辽宁省桓仁县的菌株，其EC50平均值分别为0.134 1、0.560 7、0.203 1和0.156 5 mg/L，最不敏感的是吉林省安图县的菌株，其EC50平均值为0.653 6 mg/L。

表2 氯氟醚菌唑对不同地区来源的人参灰霉病菌的EC50值比较

2.3 不同年份的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性水平

由表3可知，不同年份的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在一定差异。无论从EC50的最小值、最大值，还是平均值，2017年采集的菌株对氯氟醚菌唑的敏感性高于2018、2019年的菌株。

表3 氯氟醚菌唑对不同时间分离的人参灰葡萄孢病菌的EC50值

2.4 人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的田间抗药性监测

由表4可知，采用最小抑菌浓度法测定2020—2021年分离的246株灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感性，231株表现为敏感，平均频率为94.31%；9株为低抗菌株，抗性频率为3.66%；4株中抗菌株，抗性频率为1.63%；2株高抗菌株，抗性频率为0.81%。

表4 不同地区人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平及抗性频率

3 结论与讨论

建立病原菌对一种杀菌剂的敏感基线及进行抗药性评价，有助于优化该杀菌剂的使用策略，延长杀菌剂的使用寿命[23]。虽然氯氟醚菌唑已经在其他作物上用于防治灰霉病多年，在防治人参灰霉病上也有应用，但人参灰葡萄孢菌株对其抗药性水平尚不明确。本研究测定了采自中国东北地区人参主产省份的148株人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，确立了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线为0.1744 mg/L，对2020—2021年采自东北三省的246株灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性监测结果表明人参灰葡萄病菌对氯氟醚菌唑抗药性水平和抗性频率均较低。尽管Li et al.[17]已建立山东省草莓、芸豆、番茄和黄瓜上灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线(0.124 mg/L)，但由于人参灰霉病的用药与草莓、芸豆、番茄和黄瓜上的灰霉病用药频次有很大不同，因此有必要建立人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线，这样更有利于准确监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性水平及进行抗药性风险评估。本研究建立的人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线值(0.1744 mg/L)高于Li et al.[17]建立的黄瓜等作物灰葡萄孢的敏感基线值(0.124 mg/L)。

Li et al.[17]的研究结果表明氯氟醚菌唑与苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑之间无交互抗性，而苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑也是人参上常用的杀菌剂，因此一旦人参灰葡萄孢对这些常用的三唑类杀菌剂产生抗药性，可以用氯氟醚菌唑替代上述三唑类杀菌剂防治相应病害。

本研究表明人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑尚未产生中、高水平的抗药性，但发现不同来源的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在差异，这可能与不同地区的人参种植年限和灰霉病的发生历史、用药措施以及病菌本身的遗传差异及群体组成等因素有关。由于生产中连续大量使用同类杀菌剂或者其他有交互抗性的杀菌剂，会使病菌对杀菌剂的敏感性降低。因此，为了延缓人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑抗药性，建议要继续定期监测其抗药性情况，减少作用机制相同类型杀菌剂的使用频次，按照推荐最低有效剂量使用，并科学合理与其他药剂混用或与负交互抗药性的杀菌剂轮换使用，延长其使用寿命。