宁夏地区欧李根癌病病原菌鉴定及防治药剂筛选1)

赵岩 白田田 顾欣 王新谱 马文礼 王昊 杨波

(宁夏大学，银川，750021) (宁夏农垦农林牧技术推广服务中心)

The experiment was conducted to identify and screen microbicides against crown gall of Cerasus humilis in Ningxia. The pathogen was isolated using tissue isolation method. The pathogenicity of carrot and sunflower was determined according to robertkoch’s law using carrot and sunflower as indicator plants. The morphological, physiological and biochemical properties were analyzed, and 16S rDNA sequence analysis was used for classification and identification. The toxicity of nine low-toxic microbicides was tested by using the inhibition zone method of filter paper, and the microbicides with strong inhibitory effect on the pathogenic bacteria were screened out, and the control effect was verified with sunflower as the indicator plant. The results showed that ATJ1 strain isolated from the root cancer tissue of C. humilis could obviously proliferate on the inoculation site of carrot disk and sunflower, and was pathogenic. The ATJ1 strain was classified as Agrobacterium tumefaciens biotype I. In the indoor agent screening, tetramycin and ethephon had the best control effect, with 83.80% and 72.55% inhibition at 400×dilution, and EC50 of 5.13 and 985.75 mg/L, respectively. In pot experiments, both tetramycin and ethylicin had strong antibacterial effects on the pathogen ATJ1. No disease occurred at the inoculation site of sunflower, but high concentration of the drug would lead to phytotoxicity. Therefore, low concentrations (≥1 200×dilution) of tetramycin or ethylicin are suitable for the control of Agrobacterium tumefaciens in C. humilis.

欧李(Cerasushumilis(Bge.) Sok.)，蔷薇科(Rosaceae)樱桃属(Ceraras)多年生落叶灌木，因果实富含活性钙，又称钙果[1]，为我国特有的果树资源。欧李的根蘖更新能力强，根系发达，具有抗寒耐旱、耐瘠薄、耐盐碱等特性，果实色泽鲜艳，风味独特，营养丰富，具有较高的开发利用和研究价值[2-4]。2011年，宁夏香山地区压砂地试种欧李成功，全区多地进行引种栽培，种植面积扩大至约1 400 hm2。2015年，宁夏多地发现欧李根癌病。随着种植年限增加和栽培面积扩大，该病害在宁夏呈蔓延趋势，对当地欧李产业发展造成严重威胁。

果树根癌病是由根癌土壤杆菌引起的土传植物病害[5]。该菌寄主范围广，已知可侵染93科331属643种植物[6]，涉及核果、浆果、坚果类果树和其他观赏类植物[7]。病原菌的侵染可诱导植株大量合成生长素和细胞分裂素，导致细胞异常增殖，在根颈、侧根部位形成大小不一的冠瘿[8-9]。植株患病早期，树体的地上部无明显症状。随着冠瘿数量和体积的增加，植株细根数量减少，生长迟缓，树势逐渐衰弱，直至全株枯死，造成林果业严重损失[10-11]。根据生理生化特征和致病性差异，根癌土壤杆菌被分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型3种生物型[12-13]。桃、苹果和樱桃的根癌病菌为生物Ⅰ型或Ⅱ型，葡萄根癌病菌为生物Ⅲ型[14-17]。欧李根癌病病原菌及其生物型有待确定。

果树根癌病是典型的土传病害，主要防治技术包括选育抗病品种、物理切除、化学防治和生物防治[18]。其中，选育抗病品种难度高、耗时长；根癌组织增生发生在植株根部，对其进行物理切除既对植株造成伤害，又无法根治，易导致反复发病；化学防治主要采用蘸根、灌根或涂抹法，常用药剂有石硫合剂、硫酸铜、波尔多液和三氯异氰尿酸等[19-20]，宁夏欧李栽培区土壤均为碱性[21]，大量使用石硫合剂和波尔多液等碱性药剂不利于植物生长，硫酸铜和波尔多液等含铜化合物使用过量易造成环境污染[22]，三氯异氰尿酸对根癌土壤杆菌具有较强的抑制效果[20]，但是其与铵盐、氨、尿素混合可生成易爆的三氯化氮，遇有机物易燃，不适用于大田管理；根癌病的生物防治主要利用农用抗生素、生物源杀菌剂或生防菌，如春雷霉素、农用链霉素、大蒜、生姜、青蒿等的提取物和K84放线菌菌剂等[23-25]，由于生姜和青蒿等的提取物研究多处于试验阶段，K84菌剂只能对植株提供短期保护[26]，因此，防治根癌病仍以化学杀菌剂、农用抗生素和生物源杀菌剂为主。为了兼顾防病效果和环境保护，寻找针对欧李根癌病的高效、低毒、无污染的杀菌剂具有重要意义。

为明确宁夏欧李根癌病的病原菌并筛选出高效的防治药剂，本研究开展欧李根癌病病情调查和病原菌的分离鉴定，以胡萝卜和向日葵为指示植物进行致病性检测，并选取4种低毒化学杀菌剂和4种生物源杀菌剂，经室内毒力测定和植物药效试验，筛选能有效防治欧李根癌病的低毒杀菌剂，为该病害的绿色防控提供参考。

1 材料与方法

欧李：2年生，农大四号。

致病性检测材料：胡萝卜(春红二号)和向日葵(金谷葵3号)。

MW培养基：甘露醇10.0 g，生物素100.0 μg，KH2PO40.3 g，质量分数0.1%的Fe-EDTA 2.0 mL，NaNO35.0 g，质量分数0.1%的结晶紫2.0 mL，NaCl 0.2 g，琼脂粉15.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，水1 000 mL，121 ℃灭菌20 min，用于病原菌的分离。

营养琼脂培养基(NA)：用于病原菌的活化、保存和杀菌剂的室内毒力测定。

NA液体培养基：NA培养基不加琼脂，用于菌株液体培养。

8种杀菌剂的信息如表1。

表1 试验用杀菌剂信息

欧李根癌病病株采集：2020年6月，在宁夏简泉(38°50′37″N，106°28′53″E)欧李栽培区调查发病植株，采集全株，观察并记录植株病状和冠瘿增生情况，完成病变组织的采集。

病原菌分离：将冠瘿纵向剖开，刮取内部组织。采用马德钦等[27]的病原菌组织分离法，将病变组织稀释液接种到MW培养基上，28 ℃恒温培养48 h，挑取不同形态的菌株进行划线纯化，直至获得纯菌株，编号保存。

致病性鉴定：菌株用NA固体培养基置于28 ℃条件下活化48 h，挑取1环接种于NA液体培养基，摇床设置28 ℃、150 r/min培养48 h，制备为1 mL含1×108CFU活菌的菌悬液。

选择新鲜、无损伤的胡萝卜，清水洗净，用75%乙醇擦洗后过火干燥，切成圆片放在铺有水琼脂的培养皿内，靠近根端的一面朝上。采用涂抹法接种，用无菌棉棒蘸取菌悬液均匀涂抹在胡萝卜盘上。每个菌株接种5个盘，以无菌水为对照，置于温度28 ℃、相对湿度85%、12 h光照/12 h黑暗条件下，培养14 d，观察并统计发病情况。

选取株高10 cm的健康向日葵，以距地面3 cm的茎杆处为接种部位。先用75%乙醇消毒表面，以无菌接种针围绕茎杆轻刺4～6针，深度约1 mm，然后用无菌棉棒蘸取菌悬液涂抹针刺部位接种，每个菌株接种5株植株，以无菌水为对照。用保鲜膜包裹涂抹处以保湿。置于温度为(28±5)℃、自然光照条件下的温室培养30 d，观察接种部位增生情况。测量接种部位和接种部位上下各1 cm处的茎粗，按以下公式计算接种部位增生厚度。接种部位增生厚度=接种部位茎粗-(上茎粗+下茎粗)/2。

分类鉴定：挑取纯化后的菌株接种到MW平板上划线并置于28 ℃培养48 h，观察单菌落形态。在油镜下观察菌体形态，生理生化鉴定参照任欣正等[28]的方法，根癌土壤杆菌生物型的检测方法参考《伯杰细菌鉴定手册》[29]。

提取病原菌DNA，对其16S rDNA进行克隆、电泳和回收，委托南京奥维森基因科技有限公司完成测序。将测序结果提交至GenBank获得序列号，并使用BLAST在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库中进行比对，依据菌株序列比对信息，对菌株进行分子鉴定。在数据库中选取相近种属基因序列，使用MegaX系统分析软件构建系统进化树，确定菌株的分类地位。

室内毒力测定：采用滤纸片抑菌圈法测定8种杀菌剂对病原菌的室内毒力。用无菌水制备杀菌剂的400、600、800、1 000、1 200、1 600、2 400倍的稀释液。将直径6.0 mm的无菌干燥滤纸片在杀菌剂稀释液中蘸取2 s。在NA平板上加0.2 mL菌悬液，涂抹均匀，每皿中间放1个浸药滤纸片，每处理5个重复，以无菌水为对照，先将平皿倒置，于4 ℃培养12 h，使杀菌剂扩散和渗透均匀，再转置，于28 ℃培养24 h，观察是否出现抑菌圈。以十字交叉法测量抑菌圈直径，计算不同杀菌剂的抑菌率，公式为：抑菌率=[(处理组抑菌圈直径-对照组抑菌圈直径)/处理组抑菌圈直径]×100%。将不同稀释倍数处理的抑菌率转换成几率值(通过查“死亡百分率与几率值单位的转换表”，抑菌率相当于死亡率)，将其作为因变量(Y)，每个稀释度值的对数值作为自变量(X)，利用最小二乘法建立回归方程Y=A+BX(A为截矩，B为回归系数)[30]，获得供试杀菌剂的半最大效应浓度(EC50)值和相关系数(R2)。

防治效果盆栽试验：选取抑菌率最高和较高的杀菌剂。按致病性鉴定方法在向日葵茎杆上接种病原菌，2 h后用灭菌脱脂棉蘸取杀菌剂稀释液涂抹接种部位。以不接种病原菌，只涂抹无菌水为NCK；接种病原菌，再涂抹无菌水为CK。其他处理和培养条件同“致病性鉴定”，每处理5个重复，培养30 d，观察接种部位组织增生情况。

利用SPSS 22.0对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 欧李根癌病的田间发病症状

病株的冠瘿主要发生在根基部、主根和侧根上，植株长势未见明显异常(图1A)。冠瘿数量多为1～5个，偶见6个。冠瘿表面坚硬、龟裂，呈黑褐色，外层组织坏死，有轻微腐朽。内部呈土黄色和黄色，组织较软(图1B)。新生组织呈黄色，表面可见龟裂的新鲜韧皮组织(图1C)。

A为发病植株，黄色箭头指示根部的冠瘿；B为冠瘿剖面；C为冠瘿。

2.2 病原菌分离与致病性测定

从冠瘿中分离获得20株细菌，分别进行致病性鉴定。涂抹无菌水的胡萝卜盘和向日葵茎杆无明显增生(图2A和图2C)。不同菌株的致病性具有差异，其中ATJ1菌株的致病性最强。接种14 d，胡萝卜盘上出现乳白色肿瘤状增生凸起(图2B)。接种30 d，向日葵茎杆上形成肿瘤状增生凸起(图2D)。向日葵茎杆上的瘤体，初生时呈绿色，表面少量龟裂；成熟瘤体的皮层老化严重，呈黑褐色，表面龟裂更深。

A为接种无菌水的胡萝卜盘；B为接种ATJ1的胡萝卜盘；C为接种无菌水的向日葵；D为接种ATJ1的向日葵；黄色箭头指示接种部位。

2.3 菌株的分类鉴定

ATJ1菌株在MW培养基上置于28 ℃条件下培养48 h。菌落如图3A，呈灰白色，圆形突起，半透明，边缘整齐，有光泽。菌体呈短杆状，如图3B，大小为(0.8 μm×1.5 μm)～(0.8 μm×3.0 μm)，无荚膜和芽孢。

A为ATJ1在MW培养基上的菌落；B为油镜下观察到的ATJ1菌体(1000倍)。

将ATJ1菌株的基因测序结果登入NCBI，Genbank编号为MW541859，经基因序列BLAST比对，构建系统发育树。如图4所示，ATJ1与AgrobacteriumtumefaciensIAM 12048(NR_041396.1)菌株位于进化树同一分枝上，相似度100%，确定ATJ1菌株为根癌土壤杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)。

图4 菌株ATJ1的系统发育树

ATJ1菌株的生理生化性质和生物型检测结果如表2。依据《伯杰细菌鉴定手册》检测根癌土壤杆菌生物型的方法[29]，确定ATJ1菌株为根癌土壤杆菌生物I型菌株。

表2 ATJ1生理生化性质检测结果

2.4 室内毒力测定

滤纸片抑菌试验结果如表3和表4，8种杀菌剂对病原菌的抑菌效果具有差异。四霉素400～2 400倍稀释液对病原菌都具有抑菌作用，抑菌圈直径为51.73～6.45 mm，抑菌率为83.80%～39.21%，效果最好。乙蒜素400～2 400倍稀释液的抑菌圈直径为26.43～4.21 mm，抑菌率为72.55%～29.63%。甲基硫菌灵400倍和600倍稀释液的抑菌圈直径分别为15.11和5.16 mm，抑菌率为60.18%和34.04%，其他稀释倍数无抑菌效果。春雷霉素、喹啉铜、硫酸链霉素、噻唑锌等处理均无抑菌效果。因此，四霉素和乙蒜素对病原菌ATJ1具有较好的抑菌作用。

表3 不同杀菌剂对ATJ1菌株的抑菌圈直径

表4 不同杀菌剂对ATJ1菌株的抑菌率

根据毒力回归方程求得几率值为5(即抑菌率为50%)时的质量浓度即为ρ(EC50)。由表5可知，四霉素对病原菌ATJ1的ρ(EC50)为5.13 mg/L，乙蒜素的ρ(EC50)为985.75 mg/L。

表5 不同杀菌剂对ATJ1菌株的EC50值

2.5 防治效果盆栽试验

在向日葵茎杆上进行四霉素和乙蒜素的防效测定。结果如表6，所有涂抹四霉素和乙蒜素的部位均未出现组织增生现象。但是2种药剂400～1 000倍稀释液对向日葵组织产生药害，茎秆接种部位收缩、变黑直至干枯。稀释倍数1 200～2 400处理未出现药害，其接种部位和NCK基本一致。说明低质量浓度的四霉素和乙蒜素适用于作物上根癌病原菌的防控。

表6 四霉素和乙蒜素的防治效果

3 结论与讨论

本研究结果表明，宁夏栽培区欧李根癌病致病菌为根癌土壤杆菌生物I型，与樱桃[31]、梨[32]等果树根癌病病原菌同种，为该病害的致病机制研究和科学防治提供了参考。

果树根癌病是土传病害，病原菌可长期在土壤中生存，加之栽培环境复杂，导致防治难度较大。针对果树根癌病已开展部分杀菌剂的筛选。如农用硫酸链霉素和乙蒜素对葡萄根癌病菌具有显著的室内抑菌效果[19]。四霉素、乙蒜素和农用链霉素对樱桃根癌病菌的ρ(EC50)分别为3.03、538.27、1 435.82 mg/L[23]。本研究与前人研究结果具有差异，室内毒力测定结果显示，只有四霉素、乙蒜素和高质量浓度甲基硫菌灵对欧李根癌病菌具有一定抑菌效果。其中四霉素和乙蒜素的ρ(EC50)分别为5.13和985.75 mg/L，显著高于樱桃根癌病的抑菌试验结果，可能由病原菌不同菌株的生物学特性差异引起。

四霉素又称梧宁霉素，属于大环内酯四烯抗生素，是不吸水链霉菌梧州亚种(Streptomycesahygroscopicnwuzhouensisn subsp.)的发酵代谢物。作为广谱生物杀菌剂，四霉素对3大类病原真菌(子囊菌、担子菌和半知菌)和2大类病原细菌(革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌)均有极强的抑制作用[33]，已用于小麦赤霉病、白粉病、杨树溃疡病、细菌性角斑病和稻瘟病等的防治[34-35]。但是，四霉素对根癌土壤杆菌的抑菌机制有待进一步研究。乙蒜素是大蒜素衍生物，属于生物源农药，其抑菌机制主要是作用于病原菌体内含硫基的化合物，导致菌体代谢异常，从而起到抑菌作用[36]。乙蒜素还能增强植物光合作用，调节植物生长，促进伤口愈合再生，有利于弱苗根系复壮、老化根系复苏，提高作物抗病能力[37]。甲基硫菌灵是一种广谱性、内吸性、低毒杀真菌剂，其高质量浓度时也具有杀细菌效果，但是机制未明[38]。本研究中，只有高质量浓度甲基硫菌灵对欧李根癌病菌具有一定抑菌作用，其不宜用于根癌病的田间防治。

本研究明确了宁夏栽培区欧李根癌病致病菌为根癌土壤杆菌生物I型，经室内毒力测定和盆栽防效试验证明，四霉素和乙蒜素对该病原菌的防治效果较好。建议在欧李移栽前用低质量浓度(稀释倍数≥1 200倍)乙蒜素或四霉素蘸根处理种苗，防治根癌病的发生。