敲除TRIF基因对TLR3介导胰岛β细胞损伤的影响及机制研究*

张子月,朱祎婧,钟大鹏

1.中国人民解放军西部战区总医院干部病房，四川成都 610083；2.四川省成都新华医院药学部，四川成都 610081；3.中国人民解放军西部战区总医院内分泌科，四川成都 610083

糖尿病是一组由遗传和环境相互作用所致的代谢性疾病，据最新统计数据显示，我国18岁以上人群糖尿病患病率为11.2%[1]，已成为威胁人类健康的主要公共卫生问题之一。目前，糖尿病的发病机制尚不完全清楚，有研究发现Toll样受体家族(TLRs)所介导的非特异性炎症反应可以导致胰岛β细胞功能的损伤[2-3]。本研究团队在前期研究中亦证实，激活胰岛β细胞的Toll样受体3(TLR3)会通过TRIF信号通路释放核转录因子-κB(NF-κB)，损伤胰岛β细胞，抑制细胞的增殖和促进细胞的凋亡[4]。由此推测，在TLR3所介导的胰岛β细胞免疫损伤机制中TRIF信号通路至关重要。因此，本研究中将敲除TRIF基因，阻断TRIF信号通路，观察能否减轻胰岛β细胞的免疫损伤程度并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1细胞株 小鼠胰岛素瘤β细胞株NIT-1。

1.1.2药物及试剂 Poly(I：C)购自美国Sigma公司，DMEM、胎牛血清购自美国Hyclone公司，F-12K购自美国Gibco公司，Triton X-100购自美国Sigma公司，Rnase A solution购自上海生工生物有限公司，Light Cycler®480 SYBR Green Ⅰ Master购自瑞士Roche公司，RIPA lysis buffer、BCA蛋白定量检测试剂盒、细胞膜蛋白与细胞质蛋白提取试剂盒购自碧云天生物公司，HRP标记山羊抗兔二抗、HRP标记山羊抗小鼠二抗购自武汉三鹰生物技术有限公司，Membrane nuclear and cytoplasmic protein Extraction Kit购自上海生工生物有限公司，CCND1、CASP3购自武汉三鹰生物技术有限公司，TRIF购自英国Abcam公司，NF-κB购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.2方法

1.2.1敲除TRIF基因细胞株的制备及鉴定 利用CRISPR/Cas9技术制备敲除TRIF基因的细胞株，首先设计引物(表1)，用BbsⅠ限制性内切酶酶切pX330载体，构建pX330-sgRNA-1和pX330-sgRNA-2敲减载体，再通过细胞转染、DNA提取、PCR扩增、单克隆铺板、纯合细胞株筛选，最终得到敲除TRIF基因的细胞株。

表1 引物设计

1.2.2细胞培养及分组 以敲除TRIF基因的NIT-1细胞株为研究对象，用DMEM培养基进行细胞培养，当细胞处于增殖期比例达到80%～90%时进行实验分组，分为空白对照组和实验组。实验组根据给予不同水平的TLR3特异性激动剂病毒聚肌胞(PIC)刺激48 h，分为30 μg/mL PIC组、60 μg/mL PIC组、90 μg/mL PIC组。

1.2.3流式细胞术检测细胞周期 取敲除TRIF基因的细胞株，吸去原培养液，经胰酶消化、离心(1 000 r/min，5 min)、计数后，以2×105个/孔(12孔板)进行铺板，在5% CO2、37 ℃条件下过夜培养。次日细胞再经沉淀、离心 (1 500 r/min，10 min)后，加入200 μL DNA染液(PI溶液20 μg+ Triton X-100 1 μL+RNase A 溶液 0.2 mg+PBS定容到1 mL)，孵育(室温)15 min后检测细胞。

1.2.4Western blot检测NF-κB、CyclinD1及Caspase-3蛋白表达 取敲除TRIF基因的细胞株，经RIPA裂解后离心(12 000 r/min，10 min)，取上清液，采用BCA法测定NF-κB、CyclinD1及Caspase-3蛋白水平。具体检测方法严格按照检测试剂盒说明书进行操作。

1.2.5PCR检测NF-κB的mRNA表达 取敲除TRIF基因的细胞株，提取RNA后加入反应混合液(42 ℃反应2 min，然后置于4 ℃保持)，最后严格按照RT-PCR试剂盒说明书检测NF-κB的mRNA表达量。参照GenBank设计引物。

2 结 果

2.1敲除TRIF基因细胞株鉴定 利用CRISPR/Cas9技术，在小鼠NIT-1细胞株中敲除mouse TRIF基因，通过筛选，得到敲除TRIF基因的单克隆细胞株，见图1。

注：通过筛选，在3-4、6-4、9-5、6-7号孔板中成功制备敲除TRIF基因的细胞株，1-1和8-3号孔板为正常细胞株对照。结果显示 3-4、6-4、9-5、6-7在1 000 bp左右没有条带，500 bp左右条带明显，证明这4株细胞TRIF基因敲除彻底。图1 制备敲除TRIF基因的细胞株及鉴定

2.2细胞周期 与空白对照组相比，PIC刺激后细胞停留在G0/G1期的比例明显增加(P<0.05)，并呈浓度依赖性(P<0.05)，而细胞在S期和G2/M期的比例出现明显下调(P<0.05)，细胞增殖受抑制。见表2。

表2 刺激敲除TRIF基因细胞株的TLR3对细胞增殖的影响

2.3CyclinD1、CASP3及NF-κB蛋白表达 Western blot检测各组CyclinD1、CASP3及NF-κB表达情况。敲除TRIF基因后，刺激细胞TLR3，周期蛋白CyclinD1表达下降，凋亡蛋白CASP3及细胞因子NF-κB表达增加，差异均有统计学意义(P<0.05)，并呈浓度依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 刺激敲除TRIF基因细胞株的TLR3对CyclinD1、 CASP3及NF-κB蛋白表达的影响

2.4NF-κB mRNA表达 敲除TRIF基因后，与空白对照组相比，刺激细胞TLR3，仍能上调NF-κB mRNA表达(P<0.05)，并呈浓度依赖性(P<0.05)。与正常细胞株相比较，敲除TRIF基因细胞株的NF-κB mRNA表达差异无统计学意义(P>0.05)，均可上调NF-κB mRNA表达。见表4。

表4 分别刺激敲除TRIF基因细胞株和正常细胞株的 TLR3对NF-κB mRNA表达的影响

3 讨 论

糖尿病防治中，如何保护及改善胰岛β细胞功能一直是研究的热点，近年来免疫炎症学说备受关注。有研究发现天然免疫系统的激活可导致胰岛β细胞损伤，破坏胰岛β细胞增殖、凋亡的动态平衡，最终导致血糖的波动及糖尿病并发症的发生[5-7]。

本研究团队在前期研究中已经相继证实了小鼠胰岛β细胞表面有TLR3受体的表达，并刺激TLR3受体后，可激活NF-κB、IL-6、TNF-α等细胞因子，抑制细胞的增殖，促进其细胞凋亡[8-9]。有研究表明，TLR3的激活依赖于TRIF相关接头分子(TRAM)信号通路[10]。本研究团队在前期研究中同样发现激活NIT-1细胞的TLR3可上调TRIF mRNA表达，抑制细胞增殖，提示NIT-1细胞的损伤可能与TLR3-TRIF-NF-κB炎症信号通路有关，并且TRIF可能是整个信号通路中的关键因子。因此，在本研究中敲除小鼠胰岛β细胞TRIF基因后，再次刺激细胞TLR3，观察能否改善细胞的增殖。

本研究发现，敲除小鼠胰岛β细胞的TRIF基因后，刺激细胞TLR3，同样能刺激NF-κB的表达，促使细胞凋亡，抑制细胞增殖，也并不能保护胰岛β细胞。研究人员推测有以下原因：其一，天然免疫系统是一个极其复杂的系统，目前已知的TLRs就多达12种，同样已知的信号通路除激活TLR3的TRIF非MyD88依赖信号通路外，还有MyD88依赖信号通路[11-13]，其中TRIF介导的非MyD88依赖信号通路又可分为激活干扰素调节因子3(IRF-3)及肿瘤坏死因子受体相关因子6 (TRAF6)等多种NF-κB活化途径[12]，由此可见，本研究只阻断其中一条信号通路，并不能完全阻断炎症因子的激活。其二，细胞周期同样受到复杂分子机制调控，除常见的周期蛋白CyclinD、凋亡蛋白外[14-16]，还受其他因素调控，例如激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路，同样能导致胰岛β细胞凋亡，抑制细胞增殖[17-19]。

综上所述，敲除TRIF基因后刺激TLR3，并不能保护胰岛β细胞。但该研究为后续进一步深入研究胰岛素β细胞TLR3信号通路奠定了基础，同时也为寻找新的抑制靶点提供了新的思路。