应用二次通用旋转组合设计禾长蠕胞菌制剂配方

张建萍 段桂芳 杨爽 余柳青 陆永良 唐伟*

（1 中国水稻研究所/水稻生物育种全国重点实验室，杭州 310006；2 上海晓明检测技术服务有限公司，上海 201612；第一作者：zhangjianping@caas.cn；*通讯作者：tangwei@caas.cn）

杂草是影响水稻高产稳产的有害生物因子，目前主要依赖化学除草剂进行防治[1]。长期大量使用化学除草剂不仅造成生态环境破坏，还导致杂草产生抗药性[2]。微生物除草剂具有对环境友好等特点，是化学农药的有益补充或替代品。微生物除草剂，如真菌菌丝体、孢子等作为防治制剂使用的基本原理是用病原菌感染靶标杂草，以抑制杂草生长达到防治杂草的目的[3]。在这个过程中宿主、病原菌和环境因子对杂草防治效果都有很重要的影响，因此，需要筛选到高除草活性真菌菌株，并在适宜的环境下施用才能达到好的防治效果。

禾长蠕孢菌（Helminthosporium gramineumRabenh.f.sp．echinochloae，简称HGE）是从自然感病稗草上分离到的一种丝状真菌，能有效感染稗草、鸭舌草等杂草，但对水稻、小麦等主要作物安全，具有开发为稻田生物除草剂的潜力[4-6]。然而，HGE 在田间应用时易受环境因子，包括温度、湿度以及紫外线的影响而降低活性甚至失活。研制剂型是解决实验室高效菌株在田间应用防效下降问题的有效途径，也是将实验室效果转化为田间应用的基础保证[7]。为此，本研究在前期研究的基础上[8-10]，采用二次通用旋转组合设计HGE 孢子制剂配方，并进行田间小区试验验证，为其进一步开发和商品化生产提供依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株和稗草

HGE 分离于自然感病稗草[4]，保藏于中国水稻研究所。供试稗草种子采集于中国水稻研究所试验田，晒干后-20 ℃冷冻保藏备用。

1.2 培养基

PDB 培养基：去皮马铃薯20%，葡萄糖2%，蒸馏水。PDA 培养基：PDB 培养基添加1.7%琼脂粉。固态发酵培养基I：米粉4%，豆粕粉1%，Na3PO4·12H2O 0.2%，MgSO4·7H2O 0.1%。

1.3 菌种活化和转接体制备

将4 ℃斜面保存的HGE 转接到新鲜PDA 培养基上，28 ℃黑暗培养7 d 活化。将活化的禾长蠕胞菌株转接PDB 培养基中，28 ℃振荡培养3 d 后制成菌悬液备用。

1.4 孢子粉制备

称取1.5 L（约106.5 g）珍珠岩置于托盘中，添加4%米粉、1%豆粕粉、0.2% Na3PO4·12H2O、0.1% MgSO4·7H2O、40%蒸馏水，充分搅拌混合均匀，121 ℃高温灭菌40 min。培养基冷却后，接入8%HGE 悬液，用无菌玻棒搅拌均匀。用8 层无菌纱布覆盖托盘口，用橡皮筋固定。置于28 ℃光照培养箱中黑暗培养，期间用黑光灯12 h 循环光照诱导产孢。14 d 后收集获得孢子粉。

1.5 稗草

将稗草种子在温室中浸泡2 d，催芽露白后，挑选发芽较好的稗草种子（50 粒左右）播种于0.25 m2圆形小盆中，温室培育至2.0~3.0 叶期，备用。

1.6 试验设计

为筛选HGE 孢子制剂配方，在单因素试验结果[10]的基础上，将孢子粉按比例与增效剂、溶剂油、稳定剂和乳化剂混合均匀，配制成孢子粉剂，喷施于2.0~3.0叶期稗草上，14 d 后测定稗草株高和鲜质量防效，以稗草死亡率为考察指标，采用二次通用旋转组合实验设计，筛选增效剂（X1）、溶剂油（X2）、稳定剂（X3）和乳化剂（X4）这4 个因素的最佳配比，确定HGE 孢子制剂配方。其中，增效剂选用种类、零水平和间隔设计参考耿锐梅[11]的研究结果，混合使用增效剂A（10%吡嘧磺隆WP）+增效剂B（2.5%五氟磺草胺OD）。二次通用旋转组合实验因素水平编码表和结构矩阵见表1 和表2。

表1 二次通用旋转组合试验因素及水平表

1.7 稗草防效测定

将HGE 孢子粉与各助剂按照表2 配制，孢子粉制剂施用方法为喷雾法。用压力喷雾器对稗草叶片均匀喷洒孢子悬液100 mL/m2。将喷完药的稗苗继续在温室培养，14 d 后实测取样法调查稗草株高、鲜质量和死亡率。试验共设置25 个处理，分别为二次通用旋转组合试验设计的20 个处理，以及清水对照、不添加任何助剂的孢子粉对照、10%田间常规用量的增效剂A+增效剂B 对照、20%田间常规用量的增效剂A+增效剂B 对照和30%田间常规用量的增效剂A+增效剂B 对照。每个处理3 次重复，试验重复3 次。

表2 二次通用旋转组合试验结构矩阵

1.8 数据处理

二次通用旋转组合试验结果用DPS 数据处理系统统计分析[12]。

2 结果与分析

2.1 HGE孢子制剂对稗草的防效

HGE 孢子制剂对稗草的株高和鲜质量防效以及稗草死亡率见表3。对2.0~3.0 叶期稗草只喷施孢子粉处理时，稗草的死亡率为0，稗草株高和鲜质量防效也仅为3.11%和7.78%。而在孢子粉中添加不同比例助剂的20 个处理，株高防效、鲜质量防效及稗草死亡率均优于单独喷施孢子粉的对照处理，表明在HGE 孢子粉中添加助剂能有效提高其对稗草的防治效率。

表3 HGE 孢子制剂对稗草防效 （单位：%）

2.2 回归方程的建立与检验

二次通用旋转组合实验方案及结果如表4 所示。增效剂、溶剂油、稳定剂、乳化剂4 个因素对稗草死亡率相互作用所得方差分析结果详见表5。

利用DPS 分析软件对实验结果进行分析，得到二次回归方程为：

回归方程显著性检验结果如表4 所示。剔除不显著项后，得到回归方程（2）：

表4 二次通用旋转组合实验设计与结果

由表5 可见，回归方程失拟检验F1=1.69967（p=0.3514），差异不显著，说明控制因素对实验结果影响较小，可以进一步对回归方程进行拟合检验。显著性检验F2=24.62342（p=0.0001），达到极显著水平，说明方程与实际情况拟合良好，能够反应除草效果（死亡率）与增效剂、溶剂油、稳定剂和乳化剂的关系。

2.3 主因子效应分析

由表5 可见，回归方程一次项对稗草死亡率的影响显著，其中增效剂对稗草死亡率的影响达到极显著水平（p=0.000077<0.01），溶剂油、稳定剂和乳化剂对稗草死亡率也有显著影响（p<0.05）。回归方程的偏回归系数（即偏相关）绝对值的大小可以判明各决定因子的重要程度，系数的正负表示因子效应作用的方向[12]。因此，各因素在实验取值范围内对稗草死亡率作用大小依次为：X1（增效剂）> X4（乳化剂）> X2（溶剂油）> X3（稳定剂），其中X2为负效应，其余3 个因素均为正效应。

2.4 单因子效应分析

将4 个因素中的3 个固定在零水平，对数学模型进行降维分析，得到以其中1 个因素为决定变量的偏回归方程：

上述4 个方程其二次项系数都是负值，说明其表征的效应曲线均是一条开口向下的抛物线，即随着增效剂、溶剂油、稳定剂和乳化剂用量的不断增加，死亡率将表现出先增后减的趋势，说明这4 个因素均存在最佳值，用量太高或太低都影响其对稗草的防治效果。

2.5 互作效应分析

对数学模型的方差分析表明，交互项X1X2的p值>0.05，说明增效剂与溶剂油之间的交互作用对稗草死亡率没有显著影响。交互项X1X3和X1X4均达到显著水平（p值均小于0.05），其中X1X4达到极显著水平，说明增效剂与稳定剂、增效剂与乳化剂之间的交互作用对稗草死亡率有显著影响（表5）。

2.6 变量轮换直接寻优

根据已建立的数学模型，在-1.682≤Xi≤1.682（i=1，2，3）范围内，每个因素取5 个水平（±1.682，±1 和0），对54=625 个方案进行统计寻优，在试验范围内可得稗草最大死亡率为100%，此时各因素取值为：X1=1.682，X2=-1，X3=1.682，X4=-1.682，对应着4 种助剂的用量是：1 g 孢子粉中添加8.28 mg 增效剂A（10%吡嘧磺隆WP）、33 μL 增效剂B（2.5%五氟磺草胺OD）、0.25 mL 大豆油、0.5523 g 羧甲基纤维素钠和0.0318 g SP-20。

2.7 频率分析及统计寻优

变量轮换直接寻优法可求出优化配方组合，但没有考虑到随机因素，在实际生产中很难实现。采用计算机对不同设计水平下的组合进行模拟试验，以孢子制剂对稗草杀草活性80% 作为临界值，获得大于临界值的方案有34 个，各变量取值的频率分布见表6。表6 显示在95%置信区间、稗草死亡率大于80%的优化方案：增效剂A（10%吡嘧磺隆WP）添加量为6.56~8.10 mg，增效剂B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量为26~32 μL，大豆油添加量为0.21~0.33 mL，羧甲基纤维素钠添加量为0.49~0.53 g，SP-20 添加量为0.09~0.23 g。

表6 优化方案中Xi 取值频率分布表

然而，在现实农业生产中，微生物除草剂中化学除草剂的添加量越少越好，只要能够保证微生物除草剂的田间药效在80%以上即可；稳定剂用量也不应很多，因为在加水喷雾时，稳定剂太多可能会影响制剂在水中分散性。综合考虑各种影响因素后获得最终优化配方为：增效剂用量为常规用量的30%，即增效剂A（10%吡嘧磺隆WP）添加量为6.56 mg，增效剂B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量为26 μL，大豆油添加量为0.25 mL，羧甲基纤维素钠添加量为0.49 g，SP-20 添加量为0.10 mL。

对此配方进行试验验证，结果发现该制剂配方在温室对稗草杀草活性为100%，与理论值相符，同时对水稻生长没有负面影响，进一步证实了优化配方的可行性。

3 结论与讨论

微生物除草剂具有对生态环境友好、不易产生抗药性等优点，但田间除草效率较低，不如化学除草剂见效快、防效好[13-14]。这是因为微生物除草剂活性成分易受环境因子影响而失活或降低感染效率，再加上有些微生物除草剂对靶标杂草具有特性选择性，通常不能将田间杂草全部除掉，而是将杂草控制在一定阈值内，但对作物生长没有影响。因此，本试验采用二次通用旋转组合设计优化HGE 孢子制剂配方时，对靶标稗草防效定于80%，通过频率分析及统计寻优求得在95% 的置信区间稗草死亡率大于80%的方案有34 个，在这34 个优化方案中，4 种助剂的添加量被缩小到一定范围，在此范围内对目标杂草防效的理论值就应在80%以上，从中筛选获得符合实际生产应用的最佳制剂配方。

二次通用旋转组合设计可以在减少试验次数的同时获得较为准确的结果。该试验方法已经被研究人员广泛应用于优化数据、模型的模拟与预测中[15-17]。因本试验数据量大，为保证试验精度，提高试验效率，特选用此方法优化制剂配方中各助剂的添加量。研究结果表明，建立的数学模型拟合检验极为显著，说明方程与实际情况拟合良好，对于稗草死亡率的因子效应分析具有实际意义。4 种助剂对稗草死亡率作用大小依次为：X1（增效剂）>X4（乳化剂）>X2（溶剂油）>X3（稳定剂）。其中，增效剂对稗草死亡率影响极显著，溶剂油大豆油、稳定剂CMC 和乳化剂SP-20 对稗草死亡率影响显著。频率分析及统计寻优求得在95% 的置信区间稗草死亡率大于80%的优化方案。综合生产实际应用，将优化方案确定为：增效剂用量大约为常规用量的30%，即增效剂A（10%吡嘧磺隆WP）添加量为6.56 mg，增效剂B（2.5%五氟磺草胺OD）添加量为26 μL，大豆油添加量为0.25 mL，CMC 添加量为0.49 g，SP-20 添加量为0.10 mL。

微生物除草剂与低剂量化学除草剂复配有益于微生物除草剂商品化推广应用，这是因为二者混配后产生的菌药协同作用能降低其使用剂量，增强微生物除草剂控草效率[18]，还可改变真菌寄主选择性，扩大杀草谱[7]。PENG 等[19]报道，混合使用40%推荐剂量与亚剂量（2.3×107孢子/mL）真菌Pyricularia setariaeNiskada 孢子就能够完全控制狗尾草，仅添加10%或40%推荐剂量的烯禾啶后，能有效增强真菌对大龄狗尾草的防治效率。HEINY[20]报道，真菌（Phoma proboscis）与2,4-D和MCPA 混配后在田间能有效防治田旋花。本试验根据前期研究筛选到的对HGE 孢子相容性较好的化学除草剂五氟磺草胺和吡嘧磺隆，通过优化方案确定只需推荐用量的30%，即可有效提高HGE 除草效率，起到增效剂的作用，为今后HGE 孢子制剂的推广应用奠定了基础。