茯苓多糖对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡及Nrf2ARE信号通路的影响

梁静 陈汉仁 毛敏芸 蒋静子 彭天婵

癫痫是最常见的神经系统疾病之一，影响全球超过7 000万人，给患者、护理人员和社会带来巨大的身体、心理、社会和经济负担[1]。尽管癫痫研究取得了实质性进展，但约35%的癫痫患者对抗癫痫药有抗药性，并长期经历反复自发性癫痫发作[2]。据报道，癫痫持续状态会导致线粒体呼吸链功能障碍并导致能量衰竭，进而加剧氧化应激的严重程度，并导致海马神经元损伤或死亡[3]。因此，从抑制氧化应激，降低海马神经细胞凋亡的角度开发新的药物，对于癫痫的治疗具有重要的意义。茯苓多糖 (polysaccharides of poria cocos，PPC)来源于真菌茯苓的菌核,具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种生物活性[4]。有研究显示，PPC可抑制神经元凋亡，进而发挥对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶诱导的帕金森小鼠黑质多巴胺能神经元的保护作用[5]。本研究主要探讨PPC对癫痫大鼠海马神经细胞凋亡的影响以及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 60只SPF级SD大鼠购自广州赛业百沐生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK(粤)2020-0055，大鼠均在标准条件下饲养。动物实验均遵循3R原则，本研究得到医院动物伦理委员会的批准。

1.2 主要试剂 茯苓购自广印堂中药股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、还原型谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒均购自北京索莱宝生物科技有限公司；兔源一抗活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bax、核因子E2相关因子2 (Nrf2)、血红素氧化酶 (HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO-1)、β-actin及辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔二抗均购自天驰生物科技有限公司；TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物有限公司。

1.3 PPC的制备 参照文献[6]，用95%乙醇脱脂，水提醇沉法提取，沉淀出的多糖经Sevag法除蛋白后透析，冷冻干燥，即可得到粗多糖提取物。

1.4 癫痫大鼠模型的构建及动物分组 随机选取48只大鼠构建癫痫大鼠模型，剩余12只作为NC组。参照文献[7]进行癫痫模型构建：将大鼠按照127 mg/kg的剂量腹腔注射氯化锂，20 h后按照1 mg/kg的剂量皮下注射东莨菪碱，30 min后按照50 mg/kg的剂量腹腔注射毛果芸香碱。NC组大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化钠溶液。通过Racine分级[8]判定癫痫发作级别，4级持续>30 min进入癫痫持续状态则认为造模成功。造模成功后，将癫痫大鼠模型随机分为Model组、茯苓多糖低剂量组(PPC-L组)、茯苓多糖中剂量组(PPC-M组)、茯苓多糖高剂量组(PPC-H组)，每组12只。参考文献[9,10]及前期预实验结果，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组大鼠分别按照50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg的剂量灌胃PPC，1次/d，连续14 d。NC组和Model组灌胃等量的0.9%氯化钠溶液。

1.5 大鼠癫痫发作潜伏期测定 观察并记录5组大鼠末次给药12 h至首次出现>4级癫痫的发作时间。

1.6 Morris水迷宫实验[7](1)学习能力：将大鼠放到任意一入水点，将其游到平台的时间记为逃避潜伏期，如果在120 s内不能游到平台，就引导其爬到平台，连续训练5 d，记录第6天的逃避潜伏期。(2)空间记忆能力：第7天撤去平台，以距平台最远的地方为入水点，观察并记录大鼠120 s内穿越平台的次数。

1.7 氧化应激指标SOD、CAT、GSH水平的测定 严格按照SOD、CAT、GSH试剂盒说明书操作步骤测定大鼠海马组织中SOD、CAT、GSH水平。

1.8 TUNEL染色检测大鼠海马神经细胞凋亡 将海马组织切片脱蜡至水，加入3%H2O2及蛋白酶K孵育30 min后，再加入 50 μl TUNEL反应混合物，在37℃下孵育60 min。最后加入 DAPI 染色10 min，应用倒置显微镜观察细胞凋亡情况。细胞凋亡率(%)=(染色阳性细胞数目/细胞总数)×100%。

1.9 Western blot检测蛋白表达 RIPA裂解缓冲液裂解并提取大鼠海马组织中的总蛋白。BCA试剂盒测定蛋白质浓度，经电泳、转膜、封闭后，添加一抗Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1、β-actin，均为1∶2 000稀释，在4℃下孵育过夜，然后与HRP偶联的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h后，通过Image J 软件分析蛋白质条带灰度值。

2 结果

2.1 PPC对大鼠癫痫发作潜伏期的影响 NC组大鼠没有癫痫发作的迹象，与Model组比较，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组大鼠癫痫发作潜伏期延长，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表1。

表1 5组大鼠癫痫发作潜伏期比较

2.2 PPC对大鼠学习与记忆能力的影响 与NC组比较，Model组逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少(P<0.05)；与Model组比较，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组大鼠逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表2。

表2 5组大鼠逃避潜伏期及穿越平台次数比较

2.3 PPC对大鼠海马组织中氧化应激指标的影响 与NC组比较，Model组CAT、SOD、GSH水平明显降低(P<0.05)；与Model组比较，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组CAT、SOD、GSH水平明显升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见表3。

表3 5组大鼠海马组织中氧化应激指标SOD、CAT、GSH水平比较

2.4 PPC对大鼠海马神经细胞凋亡的影响 与NC组比较，Model组海马神经细胞凋亡率显著升高(P<0.05)；与Model组比较，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组大鼠海马神经细胞凋亡率显著降低，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图1，表4。

NC组 Model组 PPC-L组 PPC-M组 PPC-H组

表4 5组大鼠海马神经细胞凋亡率比较

2.5 PPC对5组大鼠海马组织中凋亡蛋白及(Nrf2)/抗氧化反应元件 (antioxidant response element，ARE) 通路蛋白表达的影响 与NC组比较，Model组Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达明显升高(P<0.05)，Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表达明显降低(P<0.05)；与Model组比较，PPC-L组、PPC-M组、PPC-H组大鼠海马组织中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表达降低(P<0.05)，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达升高，且呈剂量依赖性(P<0.05)。见图2，表5。

图2 western blot检测Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达；A NC组；B Model组；C PPC-L组；D PPC-M组；E PPC-H组

表5 5组大鼠海马组织中Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达比较

3 讨论

癫痫的主要特征是反复发作和一系列神经行为合并症，包括认知障碍和社会适应行为异常[11]。研究表明，氧化应激与癫痫的进展及严重程度密切相关[12]。海马组织是对学习和记忆至关重要的大脑区域，其神经元损伤可引起认知功能障碍[13]。癫痫发作后，可引起海马组织神经元损伤[14]。本研究发现大鼠存在癫痫行为，逃避潜伏期延长，穿越平台次数减少，说明癫痫大鼠模型存在认知功能障碍。SOD、CAT、GSH均为抗氧化酶，在机体中具有清除自由基的作用，其水平高则表明氧化应激受到抑制[15]。本研究发现，与NC组比较，Model组大鼠海马组织中SOD、CAT、GSH水平显著降低，海马神经细胞凋亡率及凋亡相关蛋白表达显著升高，提示在癫痫大鼠模型中氧化应激增强，海马神经细胞凋亡升高。

近年来，关于PPC在改善机体氧化应激、细胞凋亡方面的研究越来越多。如PPC提取物对小鼠酒精性肝损伤具有保护作用，其机制与抑制TLR4/NF-κB炎症信号通路，减轻氧化应激和炎症损伤有关[16]；PPC能增强肾脏抗氧化性,保护自由基介导的氧化损伤，可以治疗或延缓糖尿病肾病的发生[17]；PPC对四氯化碳诱导的小鼠肝损伤具有保护作用，其机制可能与增强肝脏抗氧化能力及减轻炎症有关[18]；PPC能抑制2型糖尿病小鼠肾组织中Bax基因过多表达，使糖尿病状态下肾组织细胞凋亡趋势受到抑制[19]。但关于PPC对癫痫大鼠氧化应激及神经细胞凋亡的影响笔者尚未见报道。本研究结果显示，与Model组比较，PPC低、中、高剂量组大鼠癫痫发作潜伏期延长，逃避潜伏期缩短，穿越平台次数增加，海马组织中SOD、CAT、GSH水平显著升高，海马神经细胞凋亡率显著降低，提示PPC可能通过提高抗氧化酶活性抑制氧化应激，从而减少神经细胞凋亡，进而发挥对癫痫大鼠的神经保护作用。

Nrf2 是抗氧化防御系统中的重要调节剂，其可与ARE结合形成Nrf2-ARE复合体，激活HO-1、NQO-1等具有抗氧化能力的酶[20]。相关研究报道，辛伐他汀通过激活Nrf2/ARE通路增强Nrf2和HO-1表达，发挥抗氧化作用、抑制细胞凋亡，实现对急性肺损伤大鼠的保护作用[21]；白藜芦醇通过其抗氧化作用抑制了草酸钙晶体对大鼠肾小管上皮细胞的损伤及黏附，此作用可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关[22]。本研究结果显示，与NC组比较，Model组大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平显著降低，提示Nrf2/ARE信号通路可能参与了癫痫大鼠的氧化应激及神经细胞凋亡过程；与Model组比较，PPC低、中、高剂量组大鼠海马组织中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表达水平显著升高，且呈剂量依赖性，提示PPC可能通过激活Nrf2/ARE信号通路抑制氧化应激，减少神经细胞凋亡，发挥抗癫痫作用。

综上所述，PPC可抑制氧化应激，减少神经细胞凋亡，发挥抗癫痫作用，该机制可能与激活Nrf2/ARE信号通路有关。