基于网络药理学和分子对接技术探讨桃红四物汤治疗膝骨关节炎的作用机制

赵士清 郭 青 叶 超 刘 越

（1 北京语言大学医院，北京 100083；2 北京中医药大学东直门医院骨二科，北京 100700；3 北京市丰台中西医结合医院，北京 100072）

膝骨关节炎（knee osteoarthritis，KOA）是以关节软骨发生破坏伴随周围骨赘形成，以膝周疼痛、关节活动受限为主的慢性退行性疾病，属中医“痹证”“痿证”范畴[1-2]。目前非甾体抗炎类作为KOA的主要治疗药物，主要在于缓解疼痛等症状，但并不能有效延缓疾病的发展，且存在消化道、肾、心血管等不良反应风险[3]。在KOA中医诊疗指南（2020年版）[2]指出，除对于有手术指征需进行手术治疗外，其余均推荐首选中西医结合疗法或单独应用中医疗法，由此可见中医药在KOA的治疗中占据重要地位。桃红四物汤始见于《医宗金鉴》，全方由桃仁、红花、当归、川芎、熟地黄及芍药组成，该方以祛瘀为核心，辅以养血、行气之功，使瘀血祛、新血生、气机畅。现代医学研究表明桃红四物汤具有扩张血管、抗炎、调节免疫等功能[4-5]。相关临床研究也显示该方治疗早期KOA的疼痛、关节活动障碍方面显示出积极的疗效[6-7]。但相关作用机制尚不十分明确。本研究应用网络药理学相关方法探析桃红四物汤治疗KOA的药理机制，为临床应用桃红四物汤治疗KOA提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 药物主要活性成分和潜在靶点 通过中药系统药理学分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP），收集桃仁、红花、当归、川芎、熟地黄、白芍的化学成分，构建数据库，利用生物利用度(OB≥30%) 和类药性指数（DL≥0.18）筛选，选择不同药物的主要活性成分及潜在靶点，通过UniProt数据库转换为人类相应标准基因，以作为桃红四物汤活性成分基因靶点，随后将所得数据导入Cytoscape 3.9.1软件构建“中药-化合物-靶点”网络图。

1.2 疾病靶点筛选 以“knee osteoarthritis”或“osteoarthritis of the knee”为检索词分别根据数据库特性检索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET数据库，重复基因靶点保留1个，最终确定KOA疾病靶点。

1.3 药物靶点与疾病相关基因集的Venn分析 将桃红四物汤化学有效成分的基因靶点与KOA相关基因集进行Venn分析，二者共有基因即为桃红四物汤治疗KOA的潜在作用靶点。

1.4 构建蛋白质相互作用关系网络（Protein-protein interaction network，PPI）将1.3得到的交集靶点导入STRING11.0平台，获得相关信息后，通过Cytoscape 3.9.1的cytoHubba工具构建蛋白质相互作用网络图，分析各靶点之间的作用关系，并通过优化与拓扑分析后选取平均值同时在度值分布（degree）、介度中心度（betweenness centrality）和接近中心度（closeness centrality）以上的靶点作为关键核心靶点。

1.5 GO及KEGG通路富集分析 Metascape 数据库导入交集靶点，选择物种为homo sapiens，获取具有显著性的富集信息（P＜0.01），基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析结果选取P值最小的10条，京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）选取P值最小的20条，再应用在线工具（http://www.bioinformatics.com.cn/）分别进行GO及KEGG富集气泡图绘制。

1.6 分子对接 将1.3中degree值前3活性成分作为配体、1.4中degree前3靶蛋白作为受体，从PDB数据库中获取靶蛋白3D结构，用Pymol 2.4.1进行预处理。Pubchem数据库获取有效成分的sdf结构，通过Chem3D软件转换成mol2文件。通过Autodock Tools 1.5.6软件将受体和配体分别进行处理，AutoDock Vina计算结合能，最终通过Pymol可视化数据。分子对接结果的平均结合能若低于-5 kcal/mol表明靶点蛋白和化合物具有较好的结合活性。

2 结果

2.1 药物主要活性成分和潜在靶点 桃红四物汤中熟地黄（2）、白芍（13）、当归（2）、川芎（7）、桃仁（23）、红花（22）药物有效成分69个，将筛重后44个有效成分编码ID。见表1。通过UniProt 转化得到的标准基因靶点代码（Gene Symbol），筛重后得到潜在靶点218个，构建“中药-化合物-靶点”网络，见图1。

图1 桃红四物汤中药—化合物—靶点网络图

表1 桃红四物汤主要活性成分信息

2.2 构建膝骨关节炎疾病相关基因集 检索GeneCards、OMIM、DrugBank、DisGeNET数据库分别得到2 331、38、73、368个相关靶点基因，获得疾病相关靶点2 810个，筛重后共得到2 486个KOA相关靶点基因，构成KOA疾病相关基因集。

2.3 药物靶点与疾病相关基因集的Venn图建立 Venn分析后得到桃红四物汤与KOA共同靶点133个靶点，见图2。

图2 桃红四物汤活性成分靶点和KOA靶点Venn图

2.4 蛋白质相互作用关系网络的构建 将133个交集靶点上传STRING11.0平台获取蛋白之间的作用关系，通过Cytoscape3.9.1的cytoHubba工具构建蛋白质互作网络（Protein-Protein Interaction Networks，PPI）（图3）。

图3 桃红四物汤治疗KOA蛋白互作网络图

2.5 核心靶点的筛选 拓扑分析后其平均度值为89.11，介度中心度均值为0.0054，近中心度均值约为0.599，筛选后得到10个靶点。见表2。排名前3的分别为TNF、IL-6、AKT1。构建“化合物—核心靶点”图，见图4。得到排名前三位的核心成分为MOL000098、MOL000422、MOL000006，即槲皮素（quercetin）、山柰酚（kaempferol）和木犀草素（Luteolin）。

图4 桃红四物汤治疗膝骨关节炎“化合物—核心靶点”图

表2 桃红四物汤治疗膝骨关节炎核心靶点

2.6 GO功能富集和KEGG通路富集分析 GO富集分析获得生物过程（BP）5 220条、细胞组成（CC）和分子功能（MF）分别为458和691条，共6 369条。选取每部分排名前10且P＜0.01的建立气泡图（图5）。KEGG通路富集分析共得到254条信号通路，筛选排名前20条通路建立气泡图（图6）。

图5 桃红四物汤治疗膝骨关节炎的GO富集分析。BP：生物过程；CC：细胞组分；MF：分子功能

图6 桃红四物汤治疗膝骨关节炎的KEGG富集分析

2.7 分子对接验证 关键活性成分与靶点的分子对接结果见表3，所有结合能均＜-5 kcal/mol，表明关键活性成分与靶蛋白之间具有较强的结合能力。以每一靶点与关键活性成分结合能最低的蛋白结构对接模式为例，进一步说明每一靶点能稳定地对接到关节活性成分蛋白结构活性口袋中，说明关键活性成分与靶点具有良好的活性（图7）。

表3 分子对接结果

图7 关键靶点和活性成分结合模式分析。A：quercetin与TNF；B：Luteolin与IL-6；C:Luteolin与AKT1

3 讨论

人口老龄化现象加重、饮食结构改变所导致的肥胖人群增多，KOA发病率逐年提高[8-10]。相关流行病学研究报道，60岁以上人群发病率超过50%[11-12]。尽管KOA的诊断和治疗有了很大的发展，西医早期主要以缓解症状为主，但并不能有效延缓疾病的发展，直到晚期仍需行人工膝关节置换，无论是经济还是心理上，对患者都造成了巨大负担和压力，且在此期间患者生活质量也大大降低[13-14]。KOA发生发展是一个复杂的病理过程，涉及多种物质，受多种途径调节[15-16]。中药复方具有多靶点、多途径的生物学效应。作为一种传统经典复方，桃红四物汤在临床上被广泛使用于治疗骨折、软组织损伤、骨关节炎等疾病，具有良好的疗效[4,7,17]。该方以祛瘀为核心，辅以养血、行气。方中以破血之品桃仁、红花为主，力主活血化瘀；以甘温之熟地、当归滋阴补肝、养血调经；芍药养血和营，以增补血之力；川芎活血行气、调畅气血，以助活血之功。许季等[18]研究发现，桃红四物汤能够有效缓解疼痛和关节僵硬等症状，同时能改善关节功能，优化骨代谢指标水平，在治疗KOA方面具有很高的潜在价值，但其作用机制不明。在本研究中，基于网络药理学，我们筛选了桃红四物汤治疗KOA的关键核心靶点和有效成分，并进行了PPI、GO和KEGG富集分析，明确了相关可能作用机制及通路，同时利用分子对接分析靶点蛋白和化合物的结合活性，为临床应用桃红四物汤治疗KOA提供科学证据。

炎症是KOA发生发展的一个重要因素[19]。促炎介质会诱导软骨细胞的凋亡和细胞外基质的降解，同时由于调亡及降解的产物进一步诱发炎症物质的产生，加重KOA病变程度[14]。本研究通过优化与拓扑分析后选取平均值同时在degree、betweenness centrality和closeness centrality以上的靶点作为关键核心靶点，筛选出10个关键核心靶点，排名前3的分别为TNF、IL-6、AKT1。TNF作为一种常见的促炎介质，受体包括TNFR1和TNFR2两种类型，均在软骨细胞和滑膜细胞中表达[20]。TNF与受体结合后，激活下游的NF-κB信号通路，从而上调炎性介质表达，诱导炎性反应的发生[21]。IL-6作为一种促炎因子，往往和TNF-α发挥协同作用，导致软骨下骨发生变化，引起炎性反应和软骨破坏[22]。此外，IL-6还可激活滑膜细胞和软骨细胞中的MAPK信号通路，启动信号级联反应，导致关节软骨的损伤[23]。研究表明，TNF、IL-6等炎性介质的不断积累导致细胞外基质的降解，同时促进软骨细胞凋亡[24-25]。而软骨细胞凋亡和细胞外基质降解是KOA进展中严重的病理变化[26]。这进一步说明炎性介质表达与KOA严重程度密切相关。AKT1作为PI3K/ATK信号通路中的重要调控因子，在调节细胞凋亡，减轻炎性反应，改善软骨退变等方面发挥着重要作用[27]。秦燕等[28]研究发现OA软骨细胞内存在AKT1明显下调现象。以上说明桃红四物汤治疗KOA与调节TNF、IL-6、AKT1的表达密切相关。

本研究发现，槲皮素、山柰酚、木犀草素是桃红四物汤治疗KOA的关键活性成分。槲皮素作为一种黄酮醇类化合物，可通过降低TNF、IL-6等炎性因子的表达水平达到抑制炎性反应以保护关节软骨的目的[29]。山柰酚具有抗炎活性，通过调控细胞极化过程，减少炎性反应，抑制滑膜炎症，保护关节软骨，达到延缓KOA发展的目的[30]。NF-κB和MAPK通路是OA发展中与炎性反应相关的关键信号转导通路，在促炎因子的诱导下，NF-κB发生活化和核易位中，从而导致炎性介质的表达，MAPKs则在软骨发生中起着至关重要的作用[31-32]。研究发现，木樨草素可降低IL-1β、TNF等炎性因子表达水平，发挥软骨保护作用[33]。以上3种主要活性成分相辅相成，共同在KOA的发展过程中发挥抗炎、保护软骨的作用，桃红四物汤方治疗KOA的疗效提供有效证据。

GO通路富集分析显示桃红四物汤作用于KOA的发展过程中，主要涉及炎性反应、细胞凋亡、转录因子反应等生物学过程，提示桃红四物汤治疗KOA可能与抑制炎性反应，调控细胞凋亡相关。KEGG通路富集分析主要涉及TNF信号通路、IL-17信号通路及PI3K/Atk信号通路。IL-17的异常表达与OA的发病及疼痛程度密切相关，阻断 IL-17信号传导途径可能会缓解 KOA 相关的疼痛[34-35]。本研究发现，IL-17信号通路在桃红四物汤治疗后显著富集，提示该分子通路可能是桃红四物汤缓解KOA疼痛的主要分子途径。TNF属于促炎细胞因子，可激活IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性细胞因子，还可激活MMP3、MMP9、MMP13等MMP类基因，调节关节局部炎性反应及软骨组织重塑[36]。本研究发现，TNF信号通路显著表达，提示桃红四物汤不仅可以调控炎性反应，还可抑制关节软骨的降解而发挥对KOA的治疗作用。PI3K/Atk信号通路参与调节多种细胞增殖、凋亡及分化等过程[37]。楼红侃等[38]研究发现该通路通过调节软骨细胞凋亡，发挥对软骨的保护作用，此外，PI3K/Atk信号通路调节软骨细胞自噬活性，在一定程度上有利于延缓OA的发展[39]。

综上所述，桃红四物汤中的槲皮素、山柰酚、木犀草素等有效成分通过TNF、IL-6等关键靶点通过TNF信号通路、IL-17信号通路及PI3K/Atk信号通路，发挥降低炎性反应、调控细胞凋亡等作用达到治疗KOA的目的，同时借助分子对接技术验证有效活性成分与关键靶点之间具有较强的结果活性，为今后研究桃红四物汤治疗KOA作用机制提供借鉴作用。但随着技术的更新迭代，数据库不断更新，现有数据也随之产生变化，相应研究结果仍需要动物实验进行验证。