RIPK1和RIPK3介导的坏死性凋亡在脑梗死中的研究进展

方子文,陈玉珍,蒙兰青

(1.右江民族医学院附属医院神经内科,广西百色 533000;2.右江民族医学院研究生学院,广西百色 533000)

随着研究的不断深入,人们发现了坏死性凋亡这种特殊的细胞死亡方式,受体相互作用蛋白激酶1(receptor interacting protein kinase 1,RIPK1)和RIPK3是介导坏死性凋亡最为关键的细胞内信号因子,当死亡受体与配体结合时,形成RIPK1/RIPK3/混合谱系激酶域样蛋白(mixedlineage kinase domain-like protein,MLKL)复合物介导细胞发生坏死性凋亡,导致炎症反应的产生。多项研究表明坏死性凋亡参与脑卒中、心肌再灌注损伤、肿瘤、免疫炎症等病理机制的发生发展,近年来备受关注。本文就RIPK1和RIPK3介导坏死性凋亡在脑梗死中的研究进展进行阐述,分析RIPK1和RIPK3介导坏死性凋亡的分子通路机制是否有可能为脑缺血损伤提供可靠的治疗靶点。

脑梗死是导致死亡和残疾的主要原因,是严重威胁我国居民健康的重大公共卫生问题。脑供血中断后发生的细胞死亡主要分为两类:坏死和凋亡[1]。坏死被定义为一种细胞溶解形式的死亡,其特征是质膜完整性的快速丧失和促炎细胞内容物的释放,是一种被动且不可调控的细胞死亡。与细胞坏死相反,细胞凋亡是一种caspase介导的细胞死亡形式,表现为细胞缩小、核固缩、碎裂,避免了质膜破裂免疫炎症的产生,是受基因自主调控的细胞死亡。与细胞坏死不同,RIPK1和RIPK3介导的坏死性凋亡是一种由众多细胞因子参与且受到高度调控的细胞死亡方式,其主要核心机制为:当caspase被抑制时,RIPK1和RIPK3磷酸化激活下游的MLKL,最终形成坏死小体引发细胞死亡[2]。这需要在特定的条件下刺激产生,如炎症介质TNFα、IFNγ、内毒素和FasL等,通过TNFR1、TNFR2、IFNR、TLR3/4和Fas/TRAILR等信号通路均可启动导致坏死性凋亡的信号级联反应[3],其中TNF的促炎作用最强,且TNF是神经系统疾病中研究最广的神经炎症因子之一,因此将以TNF/TNFR1为例来阐明坏死性凋亡信号通路。

1 TNF/TNFR1启动的坏死性凋亡

TNF与TNFR1细胞外部分的预配体组装域相互作用,诱导TNFR1三聚体形成,与TNFR1相关死亡结构域蛋白(TRADD)、RIPK1、适配蛋白2和5(TRAF2、TRAF5)、泛素连接酶1和2(cIAP1、cIAP2)、LUBAC(由Sharpin、HOIL-1和HOIP组成的线性泛素链组装复合体)结合组装成复合体Ⅰ[4]。在复合体Ⅰ中,RIPK1受多种泛素化修饰,在调节RIPK1的活化中起着关键作用[5]。当TRAF2/5和cIAP1/2催化RIPK1的K63泛素化时,生长因子-β-活化激酶1(TAK1)被募集和激活,介导下游IκB激酶(IKKs)的活化,促进核因子-κB(NF-κB)通路的激活,细胞存活[6]。研究发现cIAP1和cIAP2缺乏会导致小鼠体重快速下降和炎症发生,并伴有异常的细胞死亡[7]。因此cIAP1和cIAP2的缺乏使得RIPK1的泛素化受到抑制,加速了细胞凋亡和坏死的发生。

RIPK1的泛素化、去泛素化和磷酸化是三种不同的反应机制,其导致的结局也不同。CYLD是一种特异性去泛素化酶,可介导RIPK1的K63去泛素化,加快复合体Ⅱa形成过程。复合体Ⅱa主要包括pro-caspase-8、RIPK1、FADD和TRADD,当caspase-8未被抑制时,激活细胞发生凋亡[8]。cIAP、TAK1或NEMO表达被抑制时,复合体Ⅰ转化为一个死亡触发复合体Ⅱb,该复合体由FADD、pro-caspase-8、RIPK3和RIPK1组成。caspase-8活性不足或被抑制时,RIPK1通过RIPK同型相互作用基序(RHIM)与RIPK3相互作用使RIPK3磷酸化[9],激活下游MLKL、PGAM5和CaMKⅡ。大量研究表明MLKL的磷酸化是由RIPK3介导完成的,MLKL可在多个位点被RIPK3快速磷酸化,磷酸化的MLKL从胞质转移至细胞膜上与磷脂酰肌醇磷酸(PIP)结合,MLKL寡聚形成通透性孔道[10-11],导致质膜破裂,最终发生坏死性凋亡。同时,磷酸化的MLKL也可使线粒体上形成一个复合物,该复合物由PGAM5l连接RIPK1-RIPK3-MLKL及PGAM5s,激活动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1),最终导致线粒体裂解,引发钙超载、大量活性氧(ROS)簇生成。磷酸化的MLKL也可介导CaMKⅡ参与神经细胞ROS的过度生长以及线粒体通透性过渡孔(MPTP)的开放,细胞最终坏死引发炎症。

2 RIPK1、RIPK3通过介导坏死性凋亡参与脑缺血损伤

RIPK1和RIPK3是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的成员,该家族成员的N端因其具有同源的激酶结构域而表现出类似的生物学功能[12],但因C端结构各有差异而表现出功能上的多样性,其中以RIPK1和RIPK3的研究最为广泛。脑卒中是脑血管疾病中最常见的一类疾病,分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中,其中以缺血性脑卒中更为常见。研究如何通过干预神经元细胞的坏死和凋亡过程来提高患者预后、减少致残率一直是研究者们努力的方向。

YANG等[13]采用光血栓形成模型诱导C57小鼠大脑皮层局灶性缺血,发现敲除RIPK3和MLKL可使缺血皮质中小胶质细胞/巨噬细胞的激活从M1型转变为M2型,而M2型为缺血脑组织中的抗炎表型,此后也有研究证明了M1型巨噬细胞更容易以RIPK3激酶活性依赖的方式发生炎症相关的细胞死亡,M1型巨噬细胞则正好相反[14]。该研究发现RIPK3和MLKL缺失对病变大小和运动功能恢复也有影响,皮层局灶性缺血后,野生型动物(WT)、RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠的前肢活动立即减少到大约40%的基线水平,从第7天开始,与WT对照组相比,RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠的前肢运动显著恢复。足部故障试验表明,缺血很快导致所有小鼠出现明显的步态故障,在RIPK3-/-和MLKL-/-小鼠中,从第7天开始,足断层步数显著减少,不对称指数显著降低。以上实验结果均表明阻断RIPK3、MLKL可以减少脑缺血后神经元的损伤,并有助于功能恢复。

ZHANG等[15]建立大脑中动脉缺血再灌注(MCAO/R)模型模拟脑缺血再灌注损伤,在MCAO/R后24 h,小鼠梗死区域内检测出不可溶性RIPK1、RIPK3和MLKL的水平升高。在MCAO/R模型的基础上分别设计出两种RIP1激酶死亡小鼠(Rip1K45A/K45A和Rip1Δ/Δ mice32)、RIP3缺乏小鼠(Rip3-/-小鼠)、MLKL缺陷小鼠(Mlkl-/-小鼠)进行研究,与WT小鼠相比,Rip1K45A/K45A小鼠和Rip1Δ/Δ mice 32小鼠、Rip3-/-小鼠、Mlkl-/-小鼠均可减轻细胞坏死和神经炎症来保护MCAO/R后的脑损伤,这与坏死性凋亡通路是高度一致的,说明由RIPK1、RIPK3介导的坏死性凋亡参与了脑缺血再灌注后的脑损伤。在NAITO等[16]的一项研究中,仅靠局部脑缺血不足以上调小鼠MCAO模型中磷酸化的MLKL,上调P-MLKL需要脑缺血再灌注这一条件。因此MLKL磷酸化有可能参与介导脑缺血再灌注损伤后的细胞损伤,临床上发现有一部分急性脑梗死患者脑血管再通后出现不同程度的脑损伤,但脑缺血再灌注损伤目前机制尚未完全明确,因此这一发现是有重大意义的。

3 RIPK1在脑梗死中的研究及其干预药物

RIPK1是在细胞凋亡、坏死或存活中均起到调控作用的一个蛋白,已经成为治疗脑卒中、神经退行性疾病、自身免疫疾病和炎症疾病的治疗靶点[16-18],且这一观点得到了广泛研究的支持。在脑血管疾病的研究中,Necrostatin-1(Nec-1)是应用最多、最广的RIPK1抑制剂,Nec-1可阻断RIPK1磷酸化的发生。在MCAO大鼠模型和OGD诱导的星形胶质细胞损伤模型中,ZHU等[19]发现反应性星形胶质细胞中RIPK1显著升高,延迟给予RIPK1抑制剂Nec-1可下调胶质疤痕标志物,改善缺血性卒中诱导的坏死形态和神经功能缺损,并减少脑萎缩体积。此外,他们还发现敲低RIPK1可以减少星形胶质细胞的死亡和增殖,促进神经元轴突的生成。同时,活性星形胶质细胞中血管内皮生长因子D(VEGF-D)及其受体VEGFR-3均升高,这些结果表明RIPK1通过损害正常星形胶质细胞反应和增强星形胶质细胞VEGF-D/VEGFR-3信号通路参与星形胶质细胞病和胶质瘢痕的形成,因此,抑制RIPK1可减少星形胶质细胞增生和胶质疤痕的形成,促进脑功能恢复。

Nec-1是一种组蛋白甲基转移酶(Dot1L)抑制剂,研究发现Dot1L被敲低或抑制的卒中模型小鼠中可逆转缺血诱导的神经元凋亡,RIPK1 K63泛素化的增加和RIPK1/caspase 8复合物生成的减少可下调RIPK1依赖性的细胞凋亡,从而降低脑损伤的程度[20]。但Nec-1因其代谢稳定性差等缺点,未能获得临床应用,也已被证明不适合用于人类[21]。此外,有研究表明锌指蛋白91(zinc finger protein 91,ZFP91)可以通过诱导RIPK1去泛素化、增加线粒体ROS的产生,从而促进细胞死亡[22]。卡泊芬净是临床上常用的一种抗真菌药物,有研究发现卡泊芬净可以通过上调Pellino3(一种泛素E3连接酶)使得RIPK1泛素化增加和坏死性凋亡相关蛋白下降,改善脑梗死后的神经功能损害。研究还发现其他药物如川芎素、氯丙嗪和异丙嗪均可通过抑制RIPK1/RIPK3/MLKL通路改善梗死后的脑损伤[23-24]。

4 RIPK3在脑梗死中的研究及其干预药物

RIPK3是一种可通过caspase-8进行调控的蛋白因子,当caspase-8活性不足或被抑制时,RIPK3被磷酸化激活下游效应蛋白MLKL引发坏死性凋亡。而当RIPK3被敲除时,只能由RIPK1介导引起细胞凋亡。因此,在脑缺血后发生的坏死性凋亡中,RIPK3作为介导脑缺血后炎症反应中最具特异性的信号分子是极为关键的。研究发现当RIPK3表达下降时可通过抑制程序性细胞死亡来减少脑缺血性卒中小鼠模型中的脑梗死体积、神经功能缺损和神经元超微结构损伤,同时也进一步证实了RIPK3表达下调后稳定了线粒体膜电位,抑制了钙内流的增加和ROS的产生,从而减少了炎症的发生[25]。

通过找出RIPK3的特异性抑制剂有可能改善脑缺血后神经元的损伤和减少卒中后炎症反应的发生,但RIPK3抑制剂的临床应用一直滞后。最早一批抑制剂如GSK'840、GSK'843和GSK'872这些化合物可以高效结合并抑制RIPK3,但是当单独使用时以浓度依赖性的方式诱导细胞凋亡[3]。此前达拉非尼(Dabrafenib)被证实是有效的高亲和力RIPK3抑制剂[26],是通过竞争ATP结合位点抑制RIPK3的激酶活性,阻断TNF诱导坏死性凋亡的发生,并且在人血管内皮细胞中得到验证[27]。研究发现在栓塞诱导缺血性脑损伤1小时后的小鼠腹膜内给予Dabrafenib 10 mg/kg,第二天C57BL6小鼠的梗死灶面积明显减小,同时TNF-α的上调明显减弱,这表明Dabrafenib可能会减轻缺血性脑损伤后TNF-α诱导的坏死性途径[28],但该药物在脑卒中疾病中的临床研究鲜有相关报道。研究者采用氧糖剥夺(OGD)和MCAO模型模拟缺血性脑卒中条件,发现zad-fmk(一种凋亡抑制剂)、GSK'872(RIPK3抑制剂)联合治疗可减轻脑细胞死亡和缺血性脑损伤[29]。

5 小结

在脑梗死中坏死性凋亡介导的脑损伤机制复杂且受到多方面的严密调控,其中以RIPK1/RIPK3/MLKL通路为代表介导的细胞坏死被视为核心部分,在该通路上的任何一个蛋白信号分子以及结合位点的不同程度改变都可引起不同的结局。在此基础上发掘的一系列RIPK1、RIPK3等信号通路分子抑制剂可以在脑血管病中起到很好的神经保护作用,但在该通路中对治疗脑梗死相关临床实验以及抑制剂的药物毒性研究仍较少,未来仍需不断深入挖掘相关分子作用机制及与其他坏死通路的关系网,以期研发能用于临床上抑制坏死性凋亡的药物。