珍稀濒危植物细果秤锤树开花生物学特性和繁育系统

台昌锐 赵 凯阳艳芳 吴 彦 翟 伟 童跃伟

（安庆师范大学生命科学学院皖西南生物多样性研究与生态保护重点实验室，安庆 246133）

开花生物学在植物的生活史研究中扮演着重要角色［1］。近年来，有关猬实（Kolkwitzia amabilis）、长梗杜鹃（Rhododendron longipedicellatum）、掌叶木（Handeliodendron bodinieri）等珍稀濒危物种的开花生物学研究相继开展［2-4］，以探索其开花特性及濒危机制。同时，珍稀濒危植物的繁育系统研究对植物资源保护具有重要的指导作用，越来越受研究人员重视，也逐渐成为一热点研究课题［5-6］。它主要包括花部特征观测、传粉授粉行为和交配习性等内容［7-8］。肖宜安等［9］，林鹏等［10］，余道平等［11］，戴攀峰等［12］对于长柄双花木（Disanthus cercidifolius）、吊罗山薹草（Carex diaoluoshanica）、峨眉拟单性木兰（Parakmeria omeiensis）等濒危植物展开繁育系统研究，进一步探究其濒危机制，为濒危植物的保护和管理提供科学依据。

细果秤锤树（Sinojackia microcarpa）属安息香科（Styracaceae）秤锤树属（Sinojackia）观赏性植物［13］，该种分布范围狭窄，已知分布于临安和建德，种群数目及个体数目少，现为国家Ⅱ级重点保护野生植物［14-15］。该种在研究秤锤树属的进化以及安息香科的发育上具有重要意义［16］。由于该种种群大多分布在海拔较低，距离人类活动范围较近，由于开荒造林、修路开发等原因，其生境破坏严重。此外，该属自身存在种子空壳率较高、种子萌发困难等问题，导致物种自然更新能力较差，种群大小急剧减小，目前已处于濒危状态，亟待有效保护［14］。而有关该属植物的研究大多集中于物种资源现状［17］、形态学［18］、遗传多样性［19］等方面，对细果秤锤树开花生物学和繁育系统等方面研究鲜有报道。因此，本研究以细果秤锤树为研究对象，对自然生境下细果秤锤树的开花生物学特性和繁育系统进行研究，旨在进一步了解其开花特征和有性繁殖，为该珍稀濒危植物资源保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究地概况

研究地点位于安徽省池州市贵池区梅街镇栗山，地处安徽省老山自然保护区内（117°21′7″N；30°17′4″E），海拔约66 m。该区域属于亚热带季风亚湿润气候区，气候温暖，阳光充足，雨水充沛，四季分明，年均温在15.6～17.4 ℃，年均降水量为1 200～1 700 mm。整个种群内有细果秤锤树60 余株，主要分布在落叶阔叶林中，其林内优势树种主要 有 槲 栎（Quercus aliena）、甜 槠（Castanopsis eyrei）、板栗（Castanea mollissima）、杉木（Cunninghamia lanceolata）等乔木树种；伴生有箬竹（Indocalamus tessellatus）、檵木（Loropetalum chinense）、中华石楠（Photinia beauverdiana）、白檀（Symplocos paniculata）等灌木树种和狗脊蕨（Woodwardia japonica）、山类芦（Neyraudia montana）、贯众（Cyrtomium fortunei）、鞘柄菝葜（Smilax stans）等草本植物。

1.2 研究方法

1.2.1 花部形态特征观测

随机选取3 株植株，每株采集盛花期的花朵10 枚，并用游标卡尺对花序长度、花冠口直径、花瓣长度和宽度、雄蕊长度、花丝长度、花药长度、雌蕊长度、花柱长度进行测量；按照Dafni［20］的研究方法计算杂交指数OCI（Out-crossing index）值，判断其繁育系统的类型。

1.2.2 开花生物学观察

随机选取30枚未开放的花蕾，并挂牌标记，连续数天观察并记录开花过程，直至花朵枯萎脱落。主要观察内容为：花序的类型，花朵各组成部分的颜色、形状及数量，花蜜与气味有无，花朵开放、花粉散出、柱头伸长的时间，并记录单花花期及种群花期。

1.2.3 花粉胚珠比

随机采取10 枚新鲜花蕾置于FAA 固定液中，带回实验室进行花粉胚珠比测定。以花为单位将其花药置于蒸馏水中，用玻璃棒将花粉挤散，定容于1 mL 的离心管中，充分摇匀，取出1 μL 在显微镜下用番红染液染色后计数，每组重复3次。在光学显微镜（LEICA DM500，德国）下对子房进行解剖，并统计胚珠数量。

1.2.4 花粉活力测定

以离体培养萌发法测定细果秤锤树花粉活性。选用5%、10%、15%、20% 4 个梯度水平的蔗糖溶液及0.010、0.025、0.050 g·L-13 个梯度水平硼酸溶液，加入0.5%的琼脂制成固体培养基。每组试验重复3 次。25 ℃培养3 h，探究细果秤锤树花粉离体萌发最适条件。同时，选取最适培养基，开展花粉活性测定试验，从花蕾期开始测定，每天10：00测定1次，随机取不同植株的3朵花，并挂牌标记，每朵花做2 个切片，每个切片取3 个视野范围，每个视野范围内花粉数量要大于50枚，用平均花粉萌发率来评估花粉活力。

1.2.5 柱头可授期检测

采用联苯胺-过氧化氢法测定柱头可授性。将不同开花时间的柱头分别浸泡在联苯胺-过氧化氢反应液中。若柱头周围的反应液呈现蓝色并出现大量气泡，则柱头具有可授性；若溶液不变蓝色并无气泡产生，则不具有可授性。

1.2.6 套袋实验

在自然条件下，随机选取未开放的花蕾进行套袋试验，分别进行以下6 种处理（每种处理50枚，每组重复3 次）：①自然对照；②不去雄，套袋；③去雄，套纸袋；④去雄，套网袋；⑤去雄，套袋，人工同株异花授粉；⑥去雄，套袋，人工异株授粉。果实成熟后统计其坐果率和结籽率。

1.2.7 访花者及访花频率观察

随机选取5 个盛花期植株，对其进行连续3 d的观察记录，观察时间为08：00—18：00，以1 h 为1 个时间段对访花昆虫进行观察和记录。需记录不同访花者的访花过程，主要包括访花时间、停留时间、访花数量、访花行为等。访花频率=访花次数/观察时间，平均访花频率为不同时间段的访花频率的平均数。捕捉访花昆虫制作凭证标本，并对其进行种类鉴定。

1.2.8 数据处理

将试验相关数据用Excel 2016 软件进行统计及图表绘制，所有统计数据均用平均值±标准差表示。用SPSS 23.0 软件作单因素方差（One-way ANOVA）分析，来比较不同处理下的坐果率、结籽率、不同访花昆虫的平均访花频率之间是否差异显著。

2 结果与分析

2.1 开花生物学特征

2.1.1 花部形态特征

细果秤锤树花期在4月中上旬，种群花期可持续20 d 左右，单花期5～7 d。花为总状聚伞花序，侧生于小枝顶端（见图1）；花白色，单花为完全花，无气味；花两性，花梗和花序梗均纤细而弯垂；萼片通常5～7 裂，裂片长圆状披针形，长（12.22±0.92）mm，宽（4.54±0.48）mm。雄蕊通常10～12枚，密被短柔毛，子房半下位，3 室。花柱长（10.02±0.93）mm，线形，柱头不明显3 裂。按照Dafni［20］的标准，细果秤锤树花冠口直径为（22.51±1.66）mm，记为3；花为两性花，雌蕊先熟，记为0；雌雄蕊在空间分离，柱头高于花药，记为1；因此统计得出细果秤锤树的杂交指数≥4。根据繁育系统评判标准，其部分自交亲和，异交需要传粉者。细果秤锤树花形态各项参数值见表1。

表1 花形态各项参数值Table 1 Various morphological parameters of flower

2.1.2 开花物候

细果秤锤树单花花期5～7 d，不同天气条件下开花时间有所不同，在晴天温暖天气条件下花期较短约为5 d，在阴雨低温的天气条件下花期延长为7 d。依据开花进程，可将其花期分为5 个阶段（见图2）。①花蕾期：花蕾和柱头均呈淡绿色，花瓣未开放，雄蕊呈一轮包围雌蕊，花药膨大呈黄绿色围绕在柱头周围。②初开期：花瓣呈白色未完全展开，柱头呈淡绿色，已明显伸长且高于花药。距离柱头较近的花药呈淡黄色，已开裂，但未散粉。距离花柱较远的部分花药呈黄绿色，仍未开裂。③盛开期：白色花瓣完全展开，柱头呈白色，距离花柱较近的花药开始散出花粉，散粉后花药变得干瘪且颜色加深。距离花柱较远的部分花药依然未散粉呈淡黄色。④衰落期：此时，柱头颜色加深呈黄色，花药围绕花柱紧密排列，已全部开裂，呈黄色，花粉散出，并萎缩。⑤凋谢期：花瓣呈枯萎皱缩，花药萎缩，花粉基本散尽，柱头与花药的颜色加深，呈褐色，最后，花瓣和花药一起脱落。

图2 细果秤锤树开花动态A.花蕊期；B.初开期；C～D.盛开期；E衰落期；F～G.凋谢期Fig.2 Flowering dynamics of Sinojackia microcarpaA.Stamen stage；B.Initial opening stage；C-D.Blooming stage；E.Declining stage；F-G.Withering stage

2.1.3 花粉胚珠比

由表2 可知，细果秤锤树单花花药数量为10.70±0.82，单花花粉量为61 190.40±9 669.66，胚珠数量为15.00±2.00，花粉与胚珠比为4 093.21±498.56。依据Cruden［21］的标准，理论上细果秤锤树的交配方式是专性异交。

表2 细果秤锤树P/O值Table 2 P/O value of S.microcarpa

2.2 繁育系统特征

2.2.1 花粉活力

试验表明，15%的蔗糖溶液及0.025 g·L-1的硼酸溶液制成的固体培养基最适于细果秤锤树花粉萌发（见图3）。用该配置制成培养基测得开花前（花蕾期）细果秤锤树花粉活力较低约为5.58%，开花当天的花粉活力有所提高，约为44.05%。开花第2天的花粉活力持续增长，达58.16%。开花第3天的花粉活力最高，约为76.21%。随后细果秤锤树的花粉活力持续下降，开花第4 天、第5 天、第6天的花粉活力分别为62.96%、42.52%、34.45%，开花第7 天时花朵大多枯萎，花粉已大量散去，花粉活力较低为18.37%。花粉染色及花粉管萌发情况见图4。

图3 细果秤锤树花粉活力（n=3）Fig.3 Pollen vitality of S.microcarpa

图4 花粉染色及花粉管萌发A～B.花粉的醋酸洋红染色；C～D.花粉管生长明显Fig.4 Pollen staining and pollen tube germination A-B.Magenta acetate staining of pollen；C-D.The pollen tube grew obviously

2.2.2 柱头可授性

试验表明细果秤锤树开花前期柱头不具可授性，开花第1天柱头部分具有可授性，开花第2天的柱头可授性最高，第3天柱头具有可授性，第4天柱头可授性较低，第5天不具可授性（见表3）。

表3 细果秤锤树柱头可授性Table 3 Stigma acceptability of S.microcarpa

2.2.3 套袋处理结果

通过单因素分析显示，不同处理下的坐果率差异显著（P＜0.05），结籽率差异极显著（P＜0.01）。试验表明（表4），细果秤锤树在自然条件下结籽率为（55.33±5.03）%，结籽率较低，仅有（2.67±2.31）%。说明在自然条件下，可能存在花粉限制问题。不去雄、套袋，坐果率为0，说明其传粉需要昆虫。去雄套纸袋和去雄套网袋2种处理下，坐果率均为0，表明细果秤锤树不存在无融合生殖现象和风媒传粉。去雄人工同株异花授粉条件下，结籽率为（17.33±3.06）%，结籽率较低，仅有（1.33±1.15）%。去雄后人工异株授粉，坐果率较高，为（83.33±5.03）%，结籽率有所提高但仍较低，为（5.33±2.31）%，说明异株授粉能够提高坐果率和结籽率。

表4 不同授粉处理下细果秤锤树的坐果率和结籽率Table 4 Fruitset rate and seed set rate of S.microcarpaunder different pollination treatments

2.3 访花昆虫及访花行为

通过野外观察发现，细果秤锤树的访花昆虫有3目5科7种，主要访花昆虫有黄胸木蜂（Xylocopa appendiculata）、熊蜂（Bombussp.）、胡蜂（Vespasp.）、中华蜜蜂（Apis cerana）、黑带食蚜蝇（Episyrphus balteatus）和大黄长角蛾（Nemophora amurensis）（见图5）。蜂类访花的目的主要是采集花粉，在访花过程中其足部的采粉器及腹胸部会附着大量花粉。黄胸木蜂体型较大，在访花过程中声音较大，振幅较强，访花时间较短，每朵大概停留3～5 s，通常在同一植株上连续访问几朵花后才离开。采集花粉时通常将身体弓起，用前足紧紧抱住花，上颚抵住花粉囊，从花冠正上方开口处进入花内采集花粉。熊蜂体长体被稠密的绒毛，携粉量大，访花时间短且访花多，每朵花大概停留1～4 s。访花时，熊蜂用喙吸取花粉，前足直接落于雄蕊上，后足有花粉筐，在访花过程中足部和胸部粘有很多花粉，接触到雌蕊柱头而实现传粉。中华蜜蜂在访花时，单花停留时间5～9 s，直接落于花上，身体紧紧保住雄蕊，足部不停的摩擦花粉囊，头、胸、腹、足均与雄蕊和柱头直接接触。黑带食蚜蝇单花停留时间较长，平均为45 s，访花时落到花瓣上，在花上用中足和后足支撑身体然后采集花粉，两前足来回搓动花粉，舔舐花粉。黑带食蚜蝇虽在觅食中也能携带花粉，但体型较小且访花次数较少，对传粉的贡献不大。胡蜂访花时，足部抱住雄蕊和花柱，足部和腹部沾有花粉，平均停留时间较短（约5 s），但在观察期间访花次数较少。家蝇访花时，上颚和足部接触花粉，但在观察期间仅有2次访花行为，故并非主要访花昆虫。大黄长角蛾仅停落在花瓣上，停留时间较短，未见明显传粉行为，为无效传粉媒介。

由表5可知，不同传粉者在平均访花频率上存在显著差异（P＜0.05）。其中，黄胸木蜂和熊蜂的平均访花频率较高分别为（4.42±0.11），（8.67±0.21）次·h-1；中华蜜蜂平均访花频率约为（2.88±0.05）次·h-1，最高访花频率为3 次·h-1；胡蜂和黑带食蚜蝇的平均访花频率较低，分别为（0.39±0.05），（0.61±0.05）次·h-1。随着时间的变化，昆虫的访花频率存在显著差异（P＜0.05）（见图6），整体看来，08：00—10：00 昆虫访花频率较低，11：00—14：00昆虫对于细果秤锤树的访花频率较高，为访花高峰期，15：00—18：00 昆虫的访花频率较低。根据观察访花昆虫的访花次数与天气温度有关，在晴天温暖的中午有较多昆虫访花，而清晨和傍晚，以及阴雨低温的天气访花昆虫较少。

表5 主要访花昆虫的平均访花频率Table 5 Average visiting frequency of main flower visiting insects

图6 不同时间段昆虫访花频率Fig.6 Frequency of insect visiting flowers in different periods

3 讨论

3.1 开花生物学特征及繁育系统

从细果秤锤树的生物学特征来看，细果秤锤树在开花过程中，花朵颜色洁白，并无明显芳香气味，花朵多且聚集成一定的花序结构，从某种程度上增加了对昆虫的吸引。花形状、颜色和气味均是植物吸引昆虫进行传粉的重要条件［22-23］。花的开放方式，可视为花的表现特征，是影响其传粉成功的关键［24-25］。从花部结构上来看，细果秤锤树的柱头始终比花药高，不利于自花花粉落在柱头上。根据花部形态特征估算，细果秤锤树的杂交指数等于4，其繁育系统为部分自交亲和，异交需要传粉者。并且通过试验发现其花粉活力与柱头可授性峰期不同步，存在一定的时间间隔，避免了自花自交。套袋试验验证，细果秤锤树存在部分自交不亲和性，且不存在无融合生殖，故传粉昆虫是其传粉过程中必不可少的；异株异花授粉的坐果率明显大于自花授粉坐果率，表现为一定的近交衰退，再一次验证了细果秤锤树繁育系统是以异交为主，需要传粉者，研究结果具有一致性。

3.2 细果秤锤树有性繁殖的限制因素

根据物候观察，细果秤锤树单花花期时间仅5～7 d，而种群花期为20 d 左右，且花期大多处于梅雨季节，在开花过程中容易遭遇强降雨等恶劣天气，会导致花瓣和雄蕊直接脱落，花粉被雨水冲刷脱落、花药发生水溶性腐败等不良影响，从而导致授粉难以成功。李晓婷等［26］的研究结果表明植物的花期不同步、且种群花期较长的优势在于保证异花传粉受精的完成，另一方面降低了开花期间恶劣环境条件对其生殖过程的影响［27-28］。

传粉昆虫的限制是影响植物生殖成功的重要原因之一［29-30］。对植物访花昆虫种类的确认是传粉生物学的重要内容之一，同时也是探究该物种的濒危机制的重要前提［31］。本研究调查发现细果秤锤树在破碎化生境中传粉昆虫种类较少，且访花频率低，易受恶劣天气影响，传粉昆虫在访花时常在同一植株连续访问数朵。本研究的传粉昆虫是否为有效传粉昆虫还需进一步研究讨论。自然条件下中细果秤锤树的花较多，坐果率较高，但结籽率很低且种子大多空壳或种子发育不良，推测可能与该物种缺少传粉昆虫和传粉效率低有关。李俊兰等［32］认为大部分濒危植物缺少有效产传粉者或传粉效率不高，导致传粉环节失败，结籽率降低，变异率降低，从而严重影响种群的自我更新，致使物种的濒危［33-34］。此次调查发现，在细果秤锤树自然分布区内，罕见幼苗，其繁殖方式主要是无性繁殖，通过根部产生分蘖产生新植株，推测在传粉、胚珠受精过程存在限制因素导致种子败育。在自然状态下，细果秤锤树种群往往呈破碎化分布，种群大小不一，且距离间隔较远，异株传粉在很大程度上受到限制，对其传粉和结果具有一定影响。另外，细果秤锤树种子萌发困难，且萌发幼苗在转化成幼树的过程中易受环境胁迫，以分蘖产生克隆植株是细果秤锤树对生境破坏的一种适应对策，有利于其种群在自然界生存和繁育。毛少利等［2］对猬实的研究结果也表明植物通过根糵产生克隆植株可作为其有性生殖受阻的一个补偿，以适应特殊生境，保证其种群在自然界繁衍生息［35］。

4 结论及展望

细果秤锤树的濒危机制是多方面因素导致的，本研究从开花生物学及繁育系统角度展开相关研究发现该种存在致濒因子：花期处于梅雨季节，传粉易受天气影响；其花粉活性和柱头可授性峰期不同步，存在时间间隔，进一步影响其传粉成功；其繁育系统为部分自交亲和，异交为主，需要传粉者；传粉昆虫种类较少，且访花频率低，易受恶劣天气影响。本研究结果可为该种资源保护提供新策略，例如进行人工授粉提高坐果率和结籽率等。此外，针对在传粉环节和发育环节存在限制因素导致该种子空壳率较高且萌发率极低等问题，仍需进一步开展深入研究。