苜蓿体内H2S信号与Ca2+调节气孔运动的作用机制

郝雪峰亢春霞裴雁曦金竹萍

（1.太原师范学院，生物科学与技术学院，晋中 030619；2.山西大学，生命科学学院，特色植物资源研究与利用山西省重点实验室，太原 030006）

H2S 作为新兴的第3 种气体信号分子近年来备受关注。自1978 年Wilson 等［1］在黄瓜（Cucumis sativus）、玉米（Zea mays）、大豆（Glycine max）等高等植物中检测到内源H2S的释放，陆续有报道揭示了H2S 广泛而特殊的生理功能［2-4］。H2S 信号参与调控植物生长发育等过程，如种子萌发［5］、根系形态发生［6-7］、花期调节［8］、花器官衰老［9］、果实成熟［10］、生物合成［11-12］等；同时，H2S还能有效增强植物抵御各种生物和非生物胁迫的能力，它广泛参与氧化应激［13］、重金属［14-16］、干旱［17-18］、渗透［19］、盐分［20］、温度［5，21］和细胞自噬［22］等非生物胁迫以及病原体等［23］生物胁迫过程；其中在植物抵抗干旱胁迫过程中，H2S信号通过与植物激素和其他信号分子相互作用关闭气孔［17，24-25］。

Ca2+是生物体中最重要的信号分子之一。干旱胁迫可引发植物细胞Ca2+信号的产生，可通过调节渗透胁迫反应影响相关基因的表达，参与磷脂信号通路ABA 信号的传递来调节植物的抗旱性［26-27］。已有证据表明H2S信号和Ca2+之间存在交互作用：外源H2S 在增强植物抗旱性过程中，能够调控保卫细胞Ca2+离子通道蛋白的编码基因表达量［27］；H2S 供体预处理能提高胞外Ca2+内流，增强烟草（Nicotiana tabacum）悬浮细胞的耐热性［28］；H2S 通过对SnRK2.6 蛋白激酶的硫巯基化修饰和活性氧的积累诱导保卫细胞中Ca2+内流，从而导致气孔关闭［29］；定位于质膜上的Orai3 通道蛋白在其半胱氨酸C226和C232处经H2S修饰后限制了Ca2+的流入［30］；此外，H2S 与钙信号在植物抵御重金属Cr6+胁迫过程中的互作机制也被深入探究［14-15］。这些结果都表明Ca2+在H2S 信号转导网络中扮演着重要的角色。

苜蓿（Medicago sativa）作为我国一种重要的经济作物，近年来受环境胁迫的影响其产量大大下降，畜牧业生产中呈现出严重的供不应求，需要通过进口途径大量获得［31］。因此，研究苜蓿在抵抗干旱过程中的生理特征、提高其产量已成为亟待解决的问题。蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）由于生长周期较短、基因组较小、遗传转化效率较高和自花授粉等特点成为豆科（Fabaceae）模式植物。因此，本研究以蒺藜苜蓿为试验材料，通过研究其干旱胁迫下H2S 信号和Ca2+的关系，阐明H2S 增强植物抗旱性的作用机理，以期为H2S信号进一步应用于生产实践提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

野生型材料为蒺藜苜蓿R108，2 个突变体敲除的均为COSTIN（compact stalk internodes）基因，编码1个钙离子交换蛋白，表现为植株矮化［32］。分别记作Tnt1反转录转座子插入突变体NF3011（costin-2）和NF2734（costin-3）（购自美国诺贝尔研究所），均由中国农科院生物技术研究所牛丽芳研究员提供。主要试剂有H2S 供体NaHS（上海阿拉丁）、Ca2+离子探针Fluo-4AM（上海碧云天Beyotime）、分子生物学相关试剂（购自上海宝生物Ta-KaRa）、LaCl3等化学试剂（均为国产分析纯，购自上海生工）。

1.2 试验方法

1.2.1 RNA的提取及qRT-PCR检测

生长2 周的野生型R108 幼苗，分为2 组，对照组和生理浓度的H2S 熏蒸组（100 μmol·L-1），分别于0、1、3、6、12、24 h 取叶片，液氮冷冻-80 ℃下保存；用RNAiso Plus 试剂提取总RNA，5×All-In-One MasterMix 反转录试剂盒进行反转录，具体操作方法按照说明书进行。以cDNA 为模板，蒺藜苜蓿ACTIN基因作为内参，荧光定量PCR 仪检测钙交换器（cation/calcium exchanger 1）编码基因（MTR_6g027580）的表达，每个试验均进行3 次生物学重复（见表1）。

表1 qRT-PCR特异性引物Table 1 Specific primers of real-time PCR

1.2.2 叶片中H2S含量的测定

生长到4周龄的蒺藜苜蓿幼苗，分为正常浇水的对照组和完全不浇水的干旱组，1周后分别剪取3种植株相同部位的叶片称取质量，参考本实验室建立的测定方法［33］，利用四通道自由基测试仪（WPI，美国）的H2S 电极记录实时特征信号，通过标准曲线计算植物体内H2S的浓度。

1.2.3 测量气孔孔径

撕取3种植株（R108、NF3011、NF2734）叶片下表皮，分别置于装有4 mL PBS（pH=7.0）缓冲液的培养皿中，光照30 min 使其气孔充分张开；然后用NaHS、LaCl3溶液于光照下继续处理30 min（见表2），制片后用光学显微镜观察并测量气孔孔径。

表2 表皮条的不同处理Table 2 Different treatments of epidermal strips

1.2.4 Ca2+含量的测定

蒺藜苜蓿幼苗自然干旱1 周，取3 种植株，撕取叶片下表皮置于装有4 mL PBS（pH=7.0）的培养皿中，光照30 min；然后按表2 进行不同处理30 min；分别加入Fluo-4 AM 避光4 ℃孵育；用PBS溶液冲洗3 次，加入PBS 继续孵育4 h；制片观察，蓝光激发，红光偏移0.8，整体增益41，曝光时间150 ms左右，拍照，用Image J软件计算荧光强度。

1.3 统计分析

用Excel和SPSS statistics 17.0软件进行数据处理与单因素ANOVA分析，实际数据用平均值±标准差表示，Duncan’s测验分析处理间差异显著性。经统计分析后以不同字母表示结果具有显著性差异（显著差异表示P＜0.05；极显著差异表示P＜0.01），使用SigmaPlot 10.0及Photoshop软件作图。

2 结果与分析

2.1 钙离子转运体对H2S产生的影响

以野生型R108 和Ca2+转运体突变体植株NF3011 和NF2734 为试验材料，分别处于正常条件和干旱胁迫1 周，测定各自体内的H2S 含量（见图1）。结果表明，在正常生理状况下，突变体NF3011 和NF2734 体内H2S 的含量与野生型相比极显著降低；在干旱胁迫条件下，突变体NF3011和NF2734体内H2S的含量与野生型相比呈显著性差异；各基因型植株体内的H2S 含量与其对应的CK 相比均表现为升高，且Ca2+转运突变体的内源H2S与其相应CK相比呈显著性差异，说明植株体内H2S的产生部分依赖Ca2+转运体，两者密切相关。

图1 干旱胁迫前后野生型和突变体植株内源H2S含量的比较不同大写字母表示相同条件下不同材料间的显著性差异，而不同小写字母表示同一种材料在不同处理条件下的差异显著性（P＜0.05）；下同Fig.1 Comparison of endogenous H2S content in WT and mutants before and after drought stress Different uppercase letters indicate significant differences between different materials under the same conditions，while different lowercase letters indicate the significant difference between the same material under different treatment（sP＜0.05）；the same as below

2.2 H2S信号对钙离子转运体转录水平的影响

以野生型植株为材料分别设立对照组和NaHS 熏蒸组（100 μmol·L-1）。Ca2+转运体编码基因MTR_6g027580的表达量呈现昼夜周期性的变化趋势（见图2），H2S 熏蒸后的整体趋势与对照保持一致。具体表现为：在24 h 的处理周期内，处理前期（＜3 h）2 组的基因表达量均无显著差异；在6 h 后CK 组表达量显著增高，而NaHS 熏蒸组表达量依然保持较低水平，此时2处理组间差异极其显著；在之后的时间段内可以明显看出NaHS 熏蒸组的基因表达量明显低于对照组，12 h 时表现为显著差异。说明H2S 信号在转录水平一定程度上抑制MTR_6g027580基因的表达。

图2 H2S处理时长对MTR_6g027580基因表达量的影响不同大写字母表示相同处理条件而不同处理时间的差异显著性，不同小写字母表示不同处理条件而相同处理时间的差异显著性（P＜0.05）Fig.2 Effect of H2S treatment duration on MTR_6g027580gene expression Different uppercase letters indicate the difference significance of the same treatments but different processing time，different lowercase letters indicate the difference significant in the same processing time due to different treatment（sP＜0.05）

2.3 钙离子通道在H2S调节气孔运动中的作用

为了进一步探究H2S 与Ca2+离子通道的关系，引入H2S 供体NaHS 和Ca2+通道阻断剂LaCl3分别进行单独和联合处理，以各自CK 组的气孔孔径为基础，对同一种植株在不同处理间进行统计分析。从图3可以看出3种植株经过NaHS熏蒸处理的叶片气孔孔径，比CK 组显著或极显著减小，其大部分气孔表现为关闭状态；在加入LaCl3后，野生植株的孔径较CK 组没有明显变化，但2 种突变体孔径较CK 组变小，且NF2734 呈现为显著差异；加入LaCl3之后再进行NaHS 处理，突变体的气孔孔径较LaCl3单独处理均减小，其中NF3011 呈现显著水平，但此条件下野生型R108 的气孔孔径与其CK 处于一个水平。换句话说，H2S 信号对蒺藜苜蓿的气孔运动中的Ca2+调节，很大程度上依赖于Ca2+转运体来进行，相对而言，对Ca2+离子通道的依赖作用较小。

图3 不同处理下3种植株气孔孔径的比较Fig.3 Comparison of stomatal aperture of three plants under different treatments

2.4 体内Ca2+含量对H2S信号调节气孔运动的影响

众所周知，保卫细胞内的Ca2+含量增高会导致气孔关闭。从上述结果可知，生理浓度H2S熏蒸导致野生型和突变体的叶片气孔关闭，为了探索蒺藜苜蓿体内H2S 信号调节气孔运动过程中与体内Ca2+含量的关系，对不同材料的小表皮条进行NaHS 和LaCl3的单独和联合处理，然后通过检测保卫细胞内Ca2+的荧光强度得知二者间存在密切关联，结果如图4 所示：NaHS 熏蒸组的Ca2+含量比CK 组显著增加，说明H2S 诱导的气孔关闭是经过诱导胞内Ca2+含量升高来实现的；在加入钙离子阻断剂LaCl3后，Ca2+进入保卫细胞的能力被部分抑制，Ca2+含量降低但与对照组相比未呈现显著差异，而突变体中虽然缺失钙离子转运体，但Ca2+含量的变化与野生型相比仍然处于同一水平，说明Ca2+进入细胞少部分是依赖钙离子通道。Ca2+被阻断后再施加生理浓度H2S，野生型保卫细胞内Ca2+的含量明显增高，而突变体未呈现显著变化，进一步证明H2S 诱导气孔关闭过程中的Ca2+含量变化，很大程度依赖于Ca2+转运体。

图4 不同处理下3种植株Ca2+含量的比较A.不同处理下保卫细胞的钙离子荧光；B.不同处理下的荧光强度量化Fig.4 Comparison of Ca2+content in three plants under different treatments A.The Ca2+fluorescent of guard cellsunder different treatments；B.Fluorescence intensity quantification under different treatments

3 讨论

叶片是植物进行光合作用制造有机物的主要场所，也是在植物发展进化过程中对周围的环境比较敏感、可塑性较大的器官。气孔是植物体生长发育中与外界进行气体（CO2和O2）和水分交换的重要门户，气孔数量和孔径大小受周围环境变化的影响。前期的研究结果表明，H2S通过诱导气孔关闭增强植物的抗旱性，而气孔运动调节又是一个极其精密的调控系统，其中Ca2+的信号转导作用至关重要。因此，本研究以经济作物蒺藜苜蓿为研究材料，以其Ca2+转运突变体为突破口，外源施加生理浓度的H2S，来验证H2S 信号与Ca2+转运的关系。通过从各个水平进行的检测和观察比较，得到了Ca2+参与H2S 信号调节气孔运动过程的具体方式，这些理论数据可应用于农业生产实践，提高在各种胁迫条件下生长的作物产量。

以往研究表明当植物遭受到环境刺激后，细胞质中的Ca2+浓度会瞬间升高，然后这些钙作为信号将信息逐级传递到下游分子，从而产生相应的应答反应［34-35］。Ca2+信号转导的组分大概分为两类：一类是受钙浓度调节的蛋白（钙调素CaM、钙依赖的蛋白激酶PKC、膜联蛋白annexin 等），Ca2+的浓度变化产生钙信号，Ca2+与CaM 等受体结合，进而影响CaM 结合蛋白等靶蛋白的活性，从而调控下游基因表达和一系列生理反应［36］；另一类是Ca2+依赖的通道，包括K+和Cl-等通道相关的信号通路，大都是Ca2+依赖的通道，且这些通道在一定程度受钙信号的调节。细胞内钙浓度受调控的方式大致也分为3 类：一是通道（如质膜上有关Ca2+进出细胞相关的特异性通道、非特异性通道、细胞内细胞器膜上的相关通道）；二是细胞内的钙缓冲系统（包括各种钙结合蛋白）；三是细胞膜上离子交换通道和相关的转运蛋白（如Na+-Ca2+交换系统、相关Ca2+转运蛋白、各种钙泵等）。除上述因素直接影响细胞内的Ca2+浓度外，钙离子通道阻滞剂也是目前应用非常广泛的干预方式，外源施加可阻断Ca2+通过钙离子通道的方式进入细胞［34］。换句话说，Ca2+进出保卫细胞有2 种主要方式：Ca2+离子通道和Ca2+转运体。因此，本研究利用Ca2+转运相关的突变体（NF3011 和NF2734）（图1～2）和Ca2+的离子通道阻断剂LaCl3（图3），对H2S诱导气孔关闭过程中的气孔孔径（图3）和Ca2+含量（图4）等方面进行比较，证明了H2S 在苜蓿体内主要依赖Ca2+转运体进行信号转导的方式。

H2S 与Ca2+信号转导关系的探讨已有一些报道，试验材料大多集中在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）［27］和烟草［28］，也有推广到作物方面如谷子（Setaria italicavar.germanica）［15］；响应的环境胁迫包括热胁迫［28］、重金属胁迫［14-15］和干旱胁迫［27］等。本试验在前人研究基础上，引入重要的经济作物蒺藜苜蓿，并以其Ca2+转运相关的突变体为材料，为干旱胁迫下H2S 与Ca2+信号关系提供遗传学证据。本研究发现Ca2+缺乏会导致苜蓿体内H2S 含量减少（图1），反之，H2S 的处理也会在转录水平下调Ca2+转运体的表达（图2），说明两者不是简单的上下游关系，在信号转导网络中存在反馈调节，这与之前研究的综合结果［14，27-28］是一致的。干旱胁迫下野生型体内H2S含量未发生变化，相对而言，Ca2+转运突变体的H2S 含量显著升高（图1），意味着苜蓿体内H2S 的产生与其遭受的干旱胁迫密切相关，且此过程部分依赖于Ca2+的转运，与在拟南芥中的相关研究结果保持一致［27］。

4 结论

本研究以重要经济作物蒺藜苜蓿为试验材料，利用其Ca2+转运体突变体和Ca2+离子通道阻断剂进行试验设计，证明了H2S信号诱导蒺藜苜蓿体内细胞质Ca2+浓度升高进行信号转导的作用机制，且在此过程中，H2S 主要依赖Ca2+转运体、少部分依赖Ca2+离子通道传递信号，进而诱导气孔关闭。同时，突变体NF3011和NF2734体内的H2S含量与野生型相比极显著降低，说明钙信号对H2S存在反馈作用，二者在细胞信号转导网络中具有复杂的互作。进一步深入研究H2S 信号对植物气孔运动的作用机制，对农业实践中增强植物抗逆性、提高作物产量有重要意义。