金丝桃苷对高糖诱导海马HT22细胞氧化应激介导的神经元凋亡的保护作用研究

吴琼 崔利 张大伟 马斌斌

(1.大连医科大学附属大连市中心医院神经内科,辽宁 大连 116000；2.大连医科大学附属第二医院神经外科， 辽宁 大连 116000)

糖尿病性脑病(Diabetic encephalopathy,DE)现在被认为是糖尿病的并发症,由于全球糖尿病的发病率增加，并且在越来越年轻的患者中发生，糖尿病脑病可能会增加。现有纵向研究表明，随着时间的推移，糖尿病患者的认知功能会加速下降[1-2]。主要受影响的认知领域包括注意力、记忆力以及处理速度[3]。糖尿病与认知功能障碍之间的关系早在1922年的中就已提出[4]，发病原因与胰岛素缺乏，对神经营养因子、神经递质、氧化和凋亡应激源的表达产生有关，对其下游的影响进而导致神经元的完整性、连通性缺陷和丢失，这也通常发生在仍在发育的大脑中[5]。金丝桃苷(hyperoside,Hyp)是一种植物来源的类黄酮，主要存在于水果、果汁(主要是黄烷醇、黄酮和花青素)和中药中，具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎、保护心脑血管等作用[6-8]，临床上已广泛应用于减轻炎症、改善心血管功能等方面。然而，金丝桃苷能否通过激活Akt/GSK-3β通路保护高糖损伤下所致的HT22海马神经元氧化应激及凋亡未见报道，因此本研究拟采用高糖诱导海马HT22细胞损伤，探索金丝桃苷是否通过调控Akt/GSK-3β通路发挥抗氧化、抗细胞凋亡作用，为其临床保护神经细胞，防治脑尿病脑病相关疾病提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1试验药物 金丝桃苷为成都曼思特生物科技有限公司产品，纯度≥98%。采用二甲基亚砜(DMSO)溶解后配成10 mmol/L金丝桃苷母液，在超净台内采用0.22 μmol/L微孔滤器过滤除菌，实验用药时取少量母液稀释成相应浓度使用，其它放置-20℃冻存备用。

1.2细胞 HT22细胞复苏后接种于含有1%双抗(青霉素-链霉素)、10%FBS、90%低糖DMEM培养基中，培养基葡萄糖浓度正常(17 mmol/L)，置于37℃，体积分数5% CO2培养箱中培养。当细胞融合率至70%～80%时，传代培养，选取对数生长期的细胞进行实验。

1.3试剂 金丝桃苷购于成都曼思特生物科技有限公司；TCBN(triciribine，Akt inhibition)、p-Akt、p-Gsk3β、Caspase-3购于abcam公司；GAPDH抗体、二抗购于proteintect公司；低糖DMEM培养基购于Sigma公司；CCK8试剂购于Beyotime试剂公司；双抗、胎牛血清购于hyclone公司；活性氧检测试剂盒、BCA法蛋白检测试剂盒、ECL显影剂、Hoechst染色试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、凋亡检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司。

1.4仪器 细胞微孔板成像系统cytation5(美国Biotek公司)；倒置相差显微镜(日本奥林巴斯公司)；电泳仪、垂直电泳槽、化学发光凝胶成像系统(美国伯乐公司)；二氧化碳培养箱(Thermo公司)；低温高速离心机(德国sigma公司)。

1.5方法

1.5.1分组与给药 HT22细胞分为对照组、高糖处理组、金丝桃苷组和TCBN组。对照组:正常培养HT22细胞；高糖处理组:培养基中加入50 mmol/L高糖培养作用48 h;金丝桃苷组:培养基中分别加入100 μmol/L金丝桃苷预处理2 h后加入50 mmol/L高糖培养48 h;TCBN抑制剂组:培养基中加入金丝桃苷100 μmol/L+1 μmol/L TCBN预处理2 h，然后加入50 mmol/L高糖培养48 h。

1.5.2增强型CCK-8检测HT22细胞活力 取对数生长期的HT22细胞，经胰蛋白酶消化后，分别以每孔1×105个接种于96孔板中，每孔100 μL，细胞培养24 h后加入药物。使金丝桃苷终浓度为(0、25、50、100、200 μmol/L)的培养基培养或按照1.5.1的分组及给药方式培养48 h,每个浓度设置3个复孔。每孔加入10 μL增强型CCK-8试剂，放入培养箱孵育1～4 h，于490 nm处测定OD值。

1.5.3DCFH-DA荧光探针检测ROS水平 用无血清培养液按1∶1 000稀释DCFH-DA，使终浓度为10 mmol/L。按照1.5.1分组及给药方式培养后，吸去培养液，加入适量的DCFH-DA，充分盖住细胞，37℃培养箱孵育20 min，用无血清培养基洗涤3次，于488 nm激发波长和525 nm发射波长，采用Cytation5观察细胞内ROS表达，放大倍数4倍。同一实验平行重复3次。最后采用Image-Pro Plus 6.0软件对结果进行荧光定量分析。

1.5.4免疫荧光染色测定JC-1 按照1.5.1分组及给药方式培养48 h后,弃去培养基,PBS冲洗3次,加入1 mL JC-1染色工作液，于5% CO2培养箱中避光染色20 min，取出后用JC-1染色缓冲液冲洗2遍，置于Cytation5观察JC-1表达。

1.5.5Hoechst 33342染色 按照1.5.1分组及给药方式培养48 h后,室温条件下，将HT22细胞在4%多聚甲醛中固定15 min，Triton-X 100透化20 min，将细胞用Hoechst 33342染色液在37°C下染色10 min，用PBS洗涤两次。置于Cytation5下观察Hoechst 33342染色。

1.5.6流式细胞仪测定各组HT22细胞凋亡率 按照1.5.1分组及给药方式培养48 h后,分别收集各组细胞，取1×105个细胞，按说明处理细胞PBS洗涤细胞2次；加入500 μL Binding Buffer重悬细胞；分别加入5 μL Annexin V-FITC和PI室温避光染色10 min，进行流式细胞仪检测，分析细胞凋亡率，同一实验平行重复3次。

1.5.7Western Blot测定蛋白表达 各组HT22细胞经药物处理作用48 h后，进行p-Akt、p-GSK-3β、Caspase-3蛋白测定。经BCA法测定蛋白质含量，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，PAGE凝胶中蛋白质电转移至硝酸纤维素膜上，封闭。放入一抗中(1∶1 000)4℃杂交过夜。将PVDF膜经TBST冲洗3次后放入二抗(1∶5000)孵育1～2 h。取出PVDF膜，TBST冲洗后，吸去多余液体，铺于玻璃板上。将ECL试剂盒内的detection reagent 1与detection reagent 2等体积混合后，均匀滴在PVDF膜上，反应1～2 min。放置到化学发光凝胶系统分析仪中进行Ecl化学发光，成像，分析。

2 结 果

2.1金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞活力的影响 为了证明金丝桃苷对HT22细胞的生物安全性，将不同剂量金丝桃苷加入到DME/F12培养基中以17 mmol/L葡萄糖作为正常葡萄糖条件作用48 h以确定金丝桃苷对HT22细胞活力的影响。CCK8检测结果表明，金丝桃苷25、50、100 μmol/L浓度范围内对细胞活力没有不利影响(P>0.05)，而200 μmol/L金丝桃苷降低细胞活力(P<0.01)见图1A。与对照组相比，50 mmol/L高糖组HT22细胞活力明显降低(P<0.01)，25 μmol/L金丝桃苷组对细胞活力没有影响；50、100 μmol/L金丝桃苷组HT22细胞活力显著上升，差异具有统计学意义(P<0.01)，见图1B。以上结果提示100 μmol/L金丝桃苷对细胞活力没有任何损伤，且对高糖损伤后细胞活力有明显升高作用，表明100 μmol/L金丝桃苷可能是保护HT22免受损伤的最佳浓度，所以我们选择100 μmol/L金丝桃苷用于后续实验研究。

图1 不同浓度金丝桃苷处理HT22细胞增殖活力的影响

2.2金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞活性氧水平的影响 Cytation5结果显示，与正常对照组相比，高糖损伤后细胞内产生大量ROS,表现为强绿色荧光；金丝桃苷组ROS明显被抑制，表现荧光强度降低；TCBN组细胞内ROS增多，提示金丝桃苷保护作用被TCBN阻断，以上结果提示金丝桃苷能够减少或抑制高糖损伤后HT22细胞产生ROS，但这种保护作用能够被TCBN阻断，见图2。

2.3金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞JC-1水平的影响 Cytation5结果显示,正常组细胞JC-1呈高红低绿表达；与正常对照组相比，高糖损伤组JC-1呈高绿低红表达；与高糖损伤组比较，金丝桃苷组能增加HT22细胞JC-1表达，红色荧光增多，荧光增强，绿色荧光减少，荧光强度降低；与金丝桃苷组相比较，TCBN组JC-1表达红色荧光减少，荧光强度降低，绿色荧光增多，荧光强度增加，总体呈高绿低红荧光，见图3。以上结果提示金丝桃苷能保护高糖损伤后HT22细胞线粒体损伤，保护HT22细胞发生早期凋亡,但这种保护作用能够被TCBN所阻断。

2.4金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞Hoechst 33342染色的影响 Cytation5结果显示,与对照组相比，高糖组明显可见凋亡细胞增多；与高糖组相比，金丝桃苷组凋亡细胞数减少；与金丝桃苷组相比较，TCBN组凋亡细胞增多，以上结果提示金丝桃苷对高糖损伤HT22细胞凋亡具有保护作用，而这种作用能够被TCBN所阻断。见图4。

2.5金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞凋亡的影响 流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组相比，高糖组HT22细胞凋亡比例为38.21%，差异具有统计学意义(P<0.01);与高糖组相比，金丝桃苷组作用HT22细胞48 h后，细胞凋亡比例数减少，下降至15.74%，差异具有统计学意义(P<0.01)；与金丝桃苷组相比，TCBN组HT22细胞凋亡明显增多，从金丝桃苷组15.74增至25.71%，两组相比差异有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明金丝桃苷能保护高糖损伤HT22所导致的细胞凋亡，但这种保护作用被TCBN所阻断。见图5。

2.6金丝桃苷对高糖诱导HT22细胞p-Akt、p-GSK3β、Caspase-3水平的影响 Western blot分析显示，与正常对照组相比，高糖组p-Akt、p-GSK3β蛋白表达明显减少(P<0.01),Caspase-3蛋白表达增加(P<0.01)；与高糖组相比，金丝桃苷组p-Akt、p-GSK3β蛋白表达水平升增加(P<0.01)，Caspase-3蛋白表达下降(P<0.01)；而TCBN组p-Akt、p-GSK3β、Caspase-3蛋白表达与高糖组相似，和金丝桃苷组结果相反。以上结果提示金丝桃苷可能通过激活Akt/GSK3β信号通路增加高糖损伤后HT22细胞p-Akt、p-GSK3β蛋白表达、降低Caspase-3蛋白表达，而TCBN能阻断金丝桃苷这种作用。见图6。

3 讨 论

DE主要表现在认知功能、学习能力、智力发展和记忆恢复等方面，导致学业和专业表现受损，其机制主要与葡萄糖代谢紊乱、血管变化引发的脑内多种结构变化有关[9-10]。HT22海马神经元是参与认知、学习记忆的重要神经元细胞，在不同因素(例如谷氨酸、高糖)刺激的情况下可发生神经元凋亡[11-12]。高糖刺激后糖基化终产物、自由基等物质堆积产生大量ROS,ROS促进细胞色素C(Cyt C)的释放，进而导致体内细胞损伤,线粒体膜下位下降，发生氧化应激反应。有研究表明细胞受损后首先表现在线粒体膜电位的改变，早于形态学的变化，是细胞凋亡的早期表现[13]。ROS、JC-1、细胞凋亡率检测是反应细胞氧化应激和凋亡的主要指标。本次研究结果表明，HG作用后明显增加ROS表达，JC-1表达下降，HT22细胞凋亡数明显增加，而Hyp作用后能明显抑制ROS产生，抑制JC-1下降，增加JC-1表达，减少HT22细胞凋亡，表明Hyp具有明显的抗氧化应激、抗凋亡作用，而Akt抑制剂TCBN能明显阻断Hyp的这种作用，但其体机制有待于进一步探讨。

AKT(蛋白激酶B)/GSK-3β(糖原合成酶激酶-3)通路已被证明在神经保护中发挥关键作用，通过刺激细胞增殖和抑制细胞凋亡来增强细胞生存。据文献报道，莱菔硫烷通过激活Akt/GSK-3β信号通路改善糖尿病大鼠认知功能[14]。牛膝多肽可能通过调节PI3K/Akt/GSK-3β通路发挥对神经元凋亡的保护作用[15]。Akt是细胞存活和凋亡的重要调控因子,文献报道[16]阿尔茨海默症(Alzheimer’sDisease AD)患者大脑中的PI3K/Akt信号减弱。一般来说，在Akt激活的过程中，完全激活需要Ser473，因此Ser473磷酸化水平代表了Akt磷酸化的程度。激活的Akt磷酸化参与细胞生存、细胞周期、血管生成和代谢的靶蛋白，从而起到神经保护作用[17]。选择性下调Akt同时上调GSK-3β活性可能与脑功能失调的发病机制有关[18]。已有研究[19]表明，Akt活化可能在神经退行性疾病中发挥治疗作用。GSK-3β广泛活跃，是PI3K/Akt细胞信号转导的关键效应因子。因此，GSK-3β依赖于细胞代谢、细胞死亡和存活等细胞过程[20]。本研究结果显示，HG能减少p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达，增加Caspase-3蛋白表达，与文献报道一致[14-15]。而Hyp能明显增加p-Akt、p-GSK-3β蛋白表达，降低Caspase-3蛋白表达，但加入Akt阻断剂TCBN组结果与HG组相似，与Hyp组结果相反，以上结果提示，Hyp可能通过激活Akt/GSK-3β信号通路保护HT22细胞氧化应激及凋亡。

综上所述，本研究只是初步探讨了体外实验中Hyp的抗氧化应激及抗凋亡作用与抑制ROS表达，保护线粒体膜电位，减少细胞凋亡有关，可能是通过激活Akt/GSK-3β信号通路来实现的，但其更深入的机制还需要在体内动物模型中进一步验证。