IL-1β通过调节Stathmin/FAK通路促进人真皮成纤维细胞迁移的作用及机制

何咏磬，李凌霏，岑蕊言，邓雨萌，杨桂红，雷霞

成纤维细胞(fibroblast)是一类具有收缩功能的肌纤维母细胞表型的细胞，当皮肤创面形成后，炎症启动并加速成纤维细胞迁移，从而促进创面愈合[1-2]，但具体机制仍不十分清楚。Stathmin是一种微管解聚蛋白，参与微管动力学的调节。本课题组前期研究[3]发现，其表达水平与皮肤成纤维细胞增殖和迁移密切相关，提示Stathmin在调控皮肤创面愈合中具有重要作用，但其机制远未阐明。黏着斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)是一种非受体酪氨酸激酶，在参与调节细胞迁移和增殖等过程中起关键作用[4]，既往研究[5-6]表明，炎症可以促进FAK活化并促进细胞增殖和迁移。但FAK是否参与调节炎症状态下皮肤成纤维细胞迁移以及该过程是否与Stathmin有关均不清楚。因此，本研究拟阐明IL-1β通过调节Stathmin/FAK通路介导人真皮成纤维细胞迁移的作用和初步机制。

1 材料和方法

1.1材料 人真皮成纤维细胞(human dermal fibroblast,HDF)购自美国ATCC公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清(FBS)购自上海VivaCell公司；PBS缓冲液干粉购自索莱宝(Solarbio)公司；链霉素-青霉素双抗、0.25%胰酶(含EDTA)、BCA蛋白测定试剂盒、电转液购自碧云天公司；细胞裂解液购自北京鼎国公司；人IL-1β重组蛋白购自Sino Biological公司；FAK、Stathmin抗体购自Proteintech公司；GAPDH、Anti-rabbit IgG HRP-linked抗体购自Cell Signaling Technology(CST)公司；SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、TBST购自上海生工公司；电泳缓冲液粉剂购自塞维尔公司；PVDF膜购自美国Millipore公司；ECL超敏发光液购自硕华公司；小干扰RNA购自吉玛基因公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养和模拟体外炎症 配制加入双抗和10%胎牛血清的DMEM高糖培养基用于培养人真皮成纤维细胞。放入37 ℃、5%CO2含量的培养箱中培养2 d，待细胞融合至80%左右进行细胞传代，选择对数生长期的细胞用于后续实验。利用不同浓度的IL-1β体外刺激细胞，筛选适合的浓度(10 ng/mL)用于后续实验。实验重复3次。

1.2.2细胞划痕实验 IL-1β重组蛋白10 ng/mL处理细胞24 h，小干扰RNA进行细胞转染。待细胞在3.5 cm的培养皿中融合至80%左右，使用1 mL枪头在培养皿中进行划痕，然后用PBS缓冲液清洗3遍轻柔冲掉细胞碎片。采用倒置光学显微镜(IX73，Olympus)拍照记录。使用创面愈合率反映细胞迁移，创面愈合率=(划痕面积0 h-划痕面积24 h)/划痕面积0 h，应用Image J软件对其进行分析。实验重复3次。

1.2.3Western blot检测 人真皮成纤维细胞培养至对数生长期，IL-1β重组蛋白10 ng/mL处理细胞24 h，小干扰RNA进行细胞转染。用RIPA裂解液在冰上裂解处理好的细胞，在4 ℃条件下以21 400×g离心15 min，吸取上清液。使用BCA蛋白测定试剂盒进行蛋白定量分析。蛋白样品通过8%～12.5% SDS-PAGE加载和分离，然后将蛋白转移至PVDF膜上。转膜完毕后封闭1 h，将膜与特异性一抗(FAK、Stathmin、GAPDH)在4 ℃条件下孵育过夜。TBST清洗3遍，室温下二抗孵育1 h，TBST再洗3遍，最后使用ChemiDoc XRS系统(ChemiDoc, Bio-Rad Laboratories)曝光显影，用Image J软件对各蛋白条带的灰度值进行分析。实验重复3次。

1.2.4小干扰RNA转染 用Stathmin小干扰RNA(siSTMN)和FAK小干扰RNA(siFAK)转染细胞(siNC作为对照)，按照说明书进行操作。siNC、siSTMN或siFAK分别转染细胞24 h，然后IL-1β(10 ng/mL)处理24 h，进行检测。

2 结果

2.1IL-1β对人真皮成纤维细胞迁移的影响 当加入IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，细胞迁移较对照组明显增加(t=3.868，P<0.05)，而加入IL-1β(500 ng/mL)处理细胞24 h后，细胞迁移较对照组明显抑制(t=7.329，P<0.05)，见图1。

Note：*P<0.05,**P<0.01. The migration of human dermal fibroblasts before and after treatment with IL-1β(10 ng/mL)、IL-1β(500 ng/mL)was observed by cell scratch assay； Quantitative analysis of scratch assay图1 IL-1β处理前后对人真皮成纤维细胞迁移的影响Fig.1 Effects of IL-1β on migration of human dermal fibroblasts

2.2Stathmin蛋白表达在IL-1β调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用 Western blot检测人真皮成纤维细胞Stathmin蛋白表达情况(图2)，结果显示：IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，Stathmin蛋白表达较对照组明显增加(t=7.131，P<0.05)。

Note：**P<0.01. The expression of Stathmin protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/mL) treatment was detected by Western blot； Quantitative analysis of Western blot图2 IL-1β处理前后对人真皮成纤维细胞Stathmin蛋白表达的影响Fig.2 Effects of IL-1β on Stathmin protein expression in human dermal fibroblasts

细胞划痕实验观察细胞迁移(图3)，结果显示：IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，人真皮成纤维细胞迁移较对照组明显增加(t=8.537，P<0.05)，当使用siSTMN干扰Stathmin表达后，siSTMN组和IL-1β+siSTMN组细胞迁移均明显减弱(t=5.086、7.240，P<0.05)。

The effect of IL-1β(10 ng/mL) on the migration of human dermal fibroblasts before and after siSTMN treatment was observed by cell scratch assay； Quantitative analysis of scratch assay图3 Stathmin蛋白表达在IL-1β调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用Fig.3 Effects of Stathmin protein expression on IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

2.3FAK蛋白表达在IL-1β调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用 Western blot检测人真皮成纤维细胞FAK蛋白表达情况(图4)，结果显示：IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，FAK蛋白表达较对照组明显增加(t=5.308，P<0.05)。

Note：**P<0.01. The expression of FAK protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/mL) treatment was detected by Western blot； Quantitative analysis of Western blot图4 IL-1β处理前后对人真皮成纤维细胞FAK蛋白表达的影响Fig.4 Effects of IL-1β on FAK protein expression in human dermal fibroblasts

细胞划痕实验观察细胞迁移(图5)，结果显示：IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，人真皮成纤维细胞迁移较对照组明显增加(t=6.589，P<0.05)，当使用siFAK干扰FAK表达后，siFAK组和IL-1β+siFAK组细胞迁移均明显减弱(t=4.487、8.071，P<0.05)。

The effect of IL-1β(10 ng/mL) on the migration of human dermal fibroblasts before and after siFAK treatment was observed by cell scratch assay； Quantitative analysis of scratch assay图5 FAK蛋白表达在IL-1β调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用Fig.5 Effects of FAK protein expression on IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

2.4IL-1β通过Stathmin调控FAK介导人真皮成纤维细胞迁移的作用机制 Western blot检测人真皮成纤维细胞FAK、Stathmin蛋白表达情况(图6)，结果提示：IL-1β(10 ng/mL)处理细胞24 h后，FAK和Stathmin蛋白表达均较对照组明显增加(t=6.199、20.88，P<0.05)，当使用siSTMN干扰Stathmin表达后，siSTMN组和IL-1β+siSTMN组中FAK和Stathmin蛋白表达均明显减少(t=4.946、6.175、10.39、32.86，P<0.05)。

Note :**P<0.01, ***P<0.001, ****P<0.000 1, ns indicated no significant difference. The expression of FAK and Stathmin protein in human dermal fibroblasts before and after IL-1β(10 ng/ mL) treatment was detected by Western blot; ～ Quantitative analysis of Western blot图6 Stathmin/FAK通路在IL-1β调节人真皮成纤维细胞迁移中的作用Fig.6 Effects of Stathmin/FAK pathway in the regulation of IL-1β-induced human dermal fibroblasts migration

3 讨论

皮肤是人体面积最大的器官，在保护人体内部组织免受机械损伤、微生物感染、紫外线辐射和极端温度影响等方面起到关键作用[7]。皮肤作为身体免受外部环境影响的重要保护屏障，经常暴露或损伤于潜在的伤害中，当皮肤受损后，皮肤组织中的多种细胞会相互协调、发挥各自的作用以实现修复愈合。因此，创面修复已成为所有高等生物生存具备的重要生理过程[8]。创面愈合最主要的目标是修复受损屏障，恢复组织结构和功能完整性，从而维持内环境稳态。创面修复的过程大致可以分为三个阶段：炎症阶段、增殖阶段和组织重塑阶段[9]。创面愈合的早期炎症阶段通常需要72 h才能完成，接下来的增殖期则以大量细胞和结缔组织的积累为特征,此阶段将维持数天至数周不等[10]。本文所提到的成纤维细胞在创面修复的整个过程中都起着重要的作用，既往本课题组研究[11]发现，早期适度炎症能够通过促进成纤维细胞的迁移从而加速创面的愈合。白细胞介素-1β(IL-1β)是白细胞介素-1(IL-1)家族中的一员，是机体重要的炎症反应介质；当机体处于炎症状态或发生免疫反应时，IL-1β可参与细胞增殖、分化和迁移等多种细胞活动，此外，他还可以通过激活内皮细胞、动员中性粒细胞以及激活各类其他白细胞等方式，引发急性炎症[12]。本研究发现，使用低浓度IL-1β处理人真皮成纤维细胞后，细胞迁移明显增加，而高浓度IL-1β则会抑制细胞迁移，提示在创面修复早期给予适度的炎症刺激可以加速创面的愈合，尽管该观点被证明并接受，但其中潜在的机制仍未完全阐明。

众所周知，微管参与许多细胞生物学过程，例如细胞周期、细胞增殖、细胞内信号转导、物质转运和细胞迁移等[13]。Stathmin作为调节微管动力学的重要蛋白，广泛表达于多种组织细胞，以往对于Stathmin的研究大都与肿瘤相关。研究[14-16]发现，Stathmin的表达水平与多种肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移呈正相关，并认为其可能是肿瘤进展的潜在分子标志物，与肿瘤的分化和患者的预后都息息相关。但是Stathmin在肿瘤以外的组织细胞(例如皮肤组织)中的作用及相关研究报道较少。本课题组通过前期研究[3]发现，LPS、TNF-α等细胞因子刺激后，人真皮成纤维细胞Stathmin蛋白表达增加，通过诱导微管解聚或伪足增加，从而促进细胞迁移，然而其中的信号转导调控机制仍不清楚。为了进一步探索Stathmin在人真皮成纤维细胞迁移中的作用机制，笔者在本研究中进一步利用合适浓度的IL-1β模拟体外早期炎症反应，探索潜在的分子机制，并通过实验研究发现，IL-1β可以加速人真皮成纤维细胞迁移，而经Stathmin小干扰RNA干扰Stathmin蛋白表达后，成纤维细胞迁移显著下降，这与笔者前期的报道结论相一致，但其中机制仍然不清。

既往研究[17]揭示，FAK是一种非受体酪氨酸激酶，是胞内多种信号传导的交通枢纽，在生长发育、黏附、迁移、增殖等多个生物学过程中都起着重要的作用。不仅如此，有相关研究[18]发现，在食管鳞癌细胞中过表达Stathmin可以显著上调FAK蛋白表达，提示Stathmin/FAK通路可能参与了肿瘤细胞的迁移和侵袭。但是Stathmin/FAK通路是否参与皮肤创面愈合却并不清楚。因此，结合课题组前期发现和相关文献报道，笔者证明，IL-1β处理后的人真皮成纤维细胞Stathmin和FAK蛋白表达都显著增加，而干扰Stathmin或FAK表达后，细胞迁移均受抑，提示IL-1β可能通过调节Stathmin和FAK从而促进细胞迁移。不仅如此，当下调Stathmin表达后，FAK表达也会随之减少，并且细胞迁移受抑。进一步提示，Stathmin可能通过调控FAK继而参与IL-1β诱导的真皮成纤维细胞迁移。

综上所述，IL-1β刺激可以加速人真皮成纤维细胞迁移，继而促进创面愈合，其机制可能是通过调控Stathmin/FAK信号通路来实现，这一发现进一步揭示了创面愈合新机制并有望为临床干预早期创面愈合提供新靶点和新方向。