一种用于核酸即时检测的全集成微流控芯片*

杨馥瑞，吴梦希，刘军山

（大连理工大学辽宁省微纳米技术及系统重点实验室，辽宁大连 116024）

0 引言

病原体严重威胁人类生命健康和社会经济发展[1]。病原体的检测方法包括核酸检测、抗原抗体检测、分离培养等。其中，核酸检测具有高灵敏度和高特异性等优点，已成为病原体检测的金标准。基于常规聚合酶链式反应（PCR）的核酸检测需要在3 个不同温度之间进行几十次的扩增循环，操作复杂、耗时长。因此，研究人员开发了多种基于等温扩增的核酸检测技术，例如环介导等温扩增（LAMP）[2-3]，在恒定温度下较短时间内便可以完成核酸检测过程。

现场即时检测（Point-of-care Testing, POCT）与传统的病原学检测方法相比，具有操作简单、快速等特点[4]，在疫情防控等领域极具应用潜力。微流控芯片具有微型化、集成化和便携化等特点，特别适合用于核酸的即时检测。然而，目前大多数基于微流控芯片的核酸检测系统需要复杂昂贵的检测设备和液体驱动设备等[5-7]。例如，2010 年，德国弗赖堡大学的Lutz 等[8]研制的微流控检测系统需要离心设备进行芯片上的液体驱动。2021 年，北京航空航天大学研制了一种全集成微流控芯片，利用指压便可以实现芯片上的液体驱动，借助紫外灯可以用肉眼读出检测结果，实现了结核杆菌的现场即时检测[9]。但是，为了实现多靶标检测，该芯片需要利用复杂的阀结构实现扩增反应池间的物理隔离。2009年，美国芝加哥大学的Du等[10]提出了一种滑动式结构的微流控芯片，在芯片的基片上制作出微沟道，在芯片的滑动片上制作出液体腔室，利用两片之间的相对滑动，便可以实现不同液体腔室间的连通或者隔离。之后，又有多位学者对滑动式结构的微流控芯片进行了相关研究。例如，2011 年，美国芝加哥大学的Shen 等[11]研制了一种只有硬币大小的旋转式滑动芯片，可以连续生成纳升级液滴，用于定量检测HIV和HCV病毒。

为此，本文针对核酸现场即时检测的需求设计了一种基于LAMP 技术的全集成微流控芯片，能够完成核酸的提取和扩增功能，利用一次性注射器进行芯片上的液体驱动，借助紫外线验钞笔便可用肉眼直接读出核酸检测结果。而且，在芯片的扩增区域采用了滑动式芯片结构，实现了16个扩增反应池之间的物理隔离，因此该芯片可用于多靶标检测。

1 芯片的设计

图1（a）为本文设计的全集成微流控芯片的结构示意图，在芯片的基片上制作了微通道和试剂池等结构。根据功能，将芯片分为3 个区域：核酸提取区、混合区和扩增区，如图1（b）所示。

图1 全集成微流控芯片

（1）核酸提取区。为了实现便携化操作，选择了磁珠法进行核酸的提取，为此该区域设计了4 个试剂池：磁珠池、裂解池、清洗池1和清洗池2。磁珠法的基本原理为：磁性纳米颗粒可以与核酸分子特异性结合，利用磁场操控磁性颗粒运动，便可以在不同区域分别实现裂解、清洗等核酸提取步骤。

（2）混合区。该区域设计了1个洗脱池、1个扩增试剂池和1 个方波混合器，主要用于实现核酸的洗脱以及与扩增试剂的充分混合。为了便于操作和缩短检测时间，选择了LAMP 扩增法，因此在扩增试剂池里存放LAMP Mix试剂。

（3）扩增区。为了实现多靶标核酸检测，在该区域采用了滑动式芯片结构。在基片上设计了用于液体流动的微沟道，在滑动盖片上设计了16 个扩增反应池，利用低熔点石蜡（48～50 ℃）将扩增引物预先包埋在各个反应池内。当需要将待测溶液引入扩增反应池时，移动盖片使反应池与微沟道连通，此时由于引物被石蜡包埋在反应池底部，因此不会发生反应池间引物相互混合的现象。当需要进行扩增反应时，移动盖片使反应池与微沟道断开，从而实现各反应池之间的彻底物理隔离。

图1（c）所示为采用精密铣削制作出的聚碳酸酯（PC）微流控芯片，图1（d）所示为则为注入各种试剂后的芯片照片。

2 芯片的操作步骤

芯片的操作步骤包括实验前的芯片预备步骤和核酸检测步骤。其中，预备步骤主要包括：（1）利用移液枪将不同类型的扩增引物加入扩增反应池中，然后将低熔点石蜡融化后依次加入各反应池，待石蜡由液态转为固态时，引物便被包埋在反应池底部；（2）将磁珠、裂解液、清洗液1、清洗液2、洗脱液和LAMP Mix 试剂加入各储液池中，然后利用胶带将注液孔密封；（3）在滑动盖片与基片之间涂覆少许无菌液体石蜡，保证两片紧密贴合。

核酸检测步骤主要包括：（1）将20 μL 样品注入裂解池，在室温下保持5 min，完成裂解过程；（2）利用一根钕铁硼永磁棒移动磁珠，使其依次通过清洗池1、清洗池2 和洗脱池，磁珠在两个清洗池处各停留1 min，洗去残留的蛋白质等杂质，在洗脱池中停留3 min，使核酸脱落磁珠表面，然后将磁珠移回清洗池2 中；（3）利用一次性注射器，手动向芯片内缓慢加压，使核酸洗脱液与LAMPMix 试剂同时进入方波混合器，得到混合均匀的待测溶液；（4）再次加压，将待测溶液注入16个扩增反应池中，将滑动盖片向上推移，反应池间实现物理隔离；（5）将芯片升温至65 ℃，保持40 min，完成核酸扩增；（6）利用波长为365 nm 的紫外线验钞笔依次照射各反应池，发生了扩增反应的样品池在照射下会发出明亮的绿色荧光，而未发生扩增反应的样品池则暗淡无光。

3 结果与讨论

3.1 方波混合器

方波混合器是微流控领域中常用的一种二维混合器，主要利用尖角处的湍流和层流间的液体扩散来完成溶液混合[12]。根据Chen 等[13]的研究，在相同直径、流速以及纵向长度的情况下，方波形的混合器比其他类型的混合器效率更高。为此，结合全集成微流控芯片的外观尺寸，对方波混合器的长度和直径进行了设计。

利用COMSOL 软件对方波混合器的进样和混合效果进行了模拟仿真。在模拟气压推动液体进样时，利用了物理场中的两相流-水平集-层流。如图2（a）所示，仿真结果表明，在气体压强和受压面积相当的条件下，洗脱池与扩增试剂池中的液体（红色）可在空气（蓝色）的挤压下同时完成进样。图2（b）为对应的实验结果，可见仿真与实验结果基本一致。

图2 方波混合器进样效果图

在模拟混合效果时，采用了物理场中的单相流-层流，建立的仿真模型如图3（a）所示，进样速度设置为50 mm/s。利用参数扫描，研究了扩散系数对于出口浓度的影响（图3（b）），以及入口浓度对于混合效率的影响（图3（c））。水溶液常温条件下扩散系数为10-10～10-9m2/s 之 间，这 里 将 扩 散 系 数 设 置 为：1×10-11～1×10-9m2/s，而入口浓度设置为：1～50 mol/m3。可以看出扩散系数和入口浓度均不会影响液体的方波混合器的混合结果。同样，利用蓝红两种液体，对方波混合器的混合效果进行了实验验证。如图3（d）所示，两种颜色的液体经过方波混合器后得到了充分混合，形成了均匀的紫色。

图3 方波混合器混合效果图

3.2 滑动式扩增反应池

利用荧光素钠溶液对滑动式扩增反应池的物理隔离效果进行了实验验证。首先，在相互间隔的8 个反应池中加入相同浓度的荧光素钠溶液，待其风干后用石蜡对其进行包裹。其次，移动盖片使反应池与微沟道连通，向反应池中注入去离子水。接着，将滑动盖片向上推移，使16 个反应池实现物理隔离。然后，将芯片放置到加热板上进行加热，在65 ℃保持40 min。最后，利用紫外线验钞笔对芯片进行照射。如图4（a）所示，8 个加入了荧光素钠的反应池发出了绿色荧光，而其他8 个反应池则没有荧光产生，表明本文设计的滑动式结构可以在没有任何阀结构的情况下实现反应池间的物理隔离。

图4 扩增反应池的隔离效果验证

此外，还利用荧光显微镜对芯片进行了拍摄（荧光波长为350～500 nm），采用ImageJ图像软件对8个加入荧光素钠反应池的荧光面积和荧光强度进行了计算。如图4（b）所示，8 个反应池的荧光面积基本一致，表明初始加入的石蜡量不会影响阳性结果的判定。8 个反应池的均一化荧光强度基本相等，证明注入的去离子水能够与各扩增池中的荧光素钠完全混合，进一步证明了该滑动式扩增反应池可以满足多靶标核酸检测的要求。

4 结束语

本文设计了一种基于LAMP 技术的微流控芯片，只需要一个一次性注射器和一支紫外线验钞笔，便能够实现核酸的提取、扩增和检测功能，未来有望用于病原体的核酸即时检测。将芯片分成了3 个功能区：核酸提取区、混合区和核酸扩增区，对各功能区内的储液池和微沟道等进行了设计，探讨了核酸的提取和扩增方案，分析了芯片的工作流程。利用COMSOL 软件对芯片上的方波混合器进行了模拟仿真，并进行了实验测试，检验了混合器的液体混合能力。利用荧光素钠溶液，对芯片上的滑动式扩增反应池的物理隔离性能进行了测试，实验结果表明该结构能够在核酸扩增反应过程中实现反应池间的物理隔离，满足了芯片多靶标核酸检测的要求。