响应面法优化植物乳杆菌发酵板栗复合饮料

靳羽慧，曹 蒙，刘东咪，周 枫，张静华，李建芳

（1. 信阳农林学院 食品学院，河南 信阳 464000；2. 信阳名宴实业有限公司，河南 信阳 464000）

板栗是我国有名的传统农副产品，风味独特、营养价值丰富[1]。河南省信阳地区是我国板栗之乡，每年所生产板栗种类和数量高达几十万公斤，形成东双河板栗贸易市场等多个主要的大型板栗贸易市场，有关板栗种类和产品的研发、加工也日趋完善[2]。板栗中含有大量的可溶性糖、蛋白质、多种矿物质和维生素，具有养胃健脾、止血消肿、强筋健骨的功效，对高血压、冠心病等疾病具有较好的防治作用[3-4]。

红枣作为特色果实，其营养价值丰富，含有较多的生物活性物质，可以提高人体免疫力，含有的多糖和多酚物质，均为抗氧化剂，可清除自由基，达到延缓衰老的作用[5]。红枣含有的芦丁可以软化血管、降低血压，提高血清蛋白、降低胆固醇[6]。含有的钙和铁对预防骨质疏松及贫血具有很重要的作用[7]。

植物乳杆菌属于革兰氏阳性菌株，是不产生芽孢的兼性厌氧性乳酸菌，30~35 ℃是最佳生长温度[8]。植物乳杆菌可以利用葡萄糖、果糖及乳糖等为原料进行新陈代谢而产酸。在发酵食品分布更广，常被用于改进食品营养价值，如香肠、面包、葡萄酒和酸奶等[9]。同时，也是人体肠道内的益生菌群，改善人们的肠胃环境，对人体健康有很大促进作用[10]。有关研究表明，当摄入一定量的植物乳杆菌或其发酵食品，对人体有特定的益生保健功能[11-12]。植物乳杆菌ST-Ⅲ是一株从泡菜中筛选出来的益生菌，可调节肠道微生物菌群的平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇和调节血脂、降脂等益生功能[13]。植物乳杆菌ST-Ⅲ有较强耐受低pH 值能力，在较高pH 值的条件下存活能力更强[14]。此菌株发酵使产品在具备板栗和红枣特有香味的基础上，提高营养价值，口感更加独特的一款功能性饮料[15-16]。

以板栗和红枣为试材，添加柠檬酸、白砂糖等辅料，接入植物乳杆菌ST-Ⅲ进行发酵，利用响应面法对接种量、发酵温度和发酵时间进行优化试验。以期为我国植物乳杆菌发酵饮料方面提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

板栗，信阳市润海板栗贸易有限公司提供；和田大枣，山西昌吉市金品诚商贸有限公司提供；白砂糖，购自信阳西亚超市；柠檬酸（无水），郑州亿之源化工产品有限公司提供；植物乳杆菌ST- Ⅲ（Lactobacillus plantarum） 冻干粉，郑州百益宝生物技术有限公司提供。

1.2 主要设备

LDZM-60KCS 型立式压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂产品；DHP-260 型电热恒温培养箱，上海梅香仪器有限公司产品；JY10002 型电子分析天平，上海良平仪器仪表有限公司产品；YL-Y912 型高速破壁调理机，九阳股份有限公司产品；WYT-J 型手持折光仪，成都豪创光电仪器有限公司产品；PHSJ-3F 型pH 测量仪，济南欧莱博技术有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 工艺流程

①挑选→脱壳→加入0.11%柠檬酸溶液打浆→煮浆→过滤→板栗汁；

②红枣汁制备。挑选→水煮→打浆→过滤→红枣汁；

①+②→混合→复配→杀菌→冷却→灌装→接种→发酵→121 ℃保持15 min 灭菌→冷却至80 ℃→封盖成品。

1.3.2 单因素试验

（1） 植物乳杆菌接种量对复合饮料感官品质的影响。以板栗汁∶红枣汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味剂充分搅拌均匀，植物乳杆菌ST-Ⅲ接种量分别为1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%，在35 ℃下发酵48 h，对发酵后的饮料进行感官评价。

（2） 植物乳杆菌发酵温度对复合饮料感官品质的影响。以板栗汁∶红枣汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味剂充分搅拌均匀，接入3.0%植物乳杆菌ST-Ⅲ，分别在发酵温度25，30，35，40，45 ℃下发酵48 h，对发酵后的饮料进行感官评价。

（3） 植物乳杆菌发酵时间对复合饮料感官品质的影响。以板栗汁∶红枣汁= 3∶1 混合，然后加入7%白砂糖，0.06%酸味剂充分搅拌均匀，接入3.0%植物乳杆菌ST-Ⅲ，控制发酵温度35 ℃，分别发酵24，36，48，60，72 h，对发酵后的饮料进行感官评价。

1.3.3 响应面试验

在单因素试验基础上，选择植物乳杆菌ST-Ⅲ接种量、发酵温度和时间3 个考查因素，以感官评分为响应值，根据Box-behnken 设计中心试验原理，采用Design Expert10.0 响应面设计三因素三水平试验。

Box-behnken 试验因素与水平见表1。

表1 Box-behnken 试验因素与水平

1.3.4 感官评定方法

选择10 名食品相关专业有品评经验人员组成评定小组，依据板栗复合饮料感官评分标准[17]（见表2），从板栗复合饮料的外观色泽、组织结构、滋味及风味4 个方面进行综合感官评分，满分为100 分，取平均值。

板栗复合饮料感官评分标准见表2。

表2 板栗复合饮料感官评分标准

1.3.5 理化指标测定

（1） 总酸。符合GB/T 12456—2008 标准，采用指示剂法检测样品中的总酸含量。

（2） pH 值。符合GB 19297—2003 标准，采用pH 测定仪。

（3） 可溶性固形物。符合GB/T 12143—2008 标准，采用手持式折光仪（20 ℃）。

（4） 菌落总数。符合GB 4789.2—2016 标准，采用平板计数法。

1.3.6 数据分析使用Origin 9.0 软件和Design Expert 10.0 响应面分析软件，对试验数据进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果与分析

2.1.1 接种量对板栗复合饮料发酵的影响

在板栗红枣汁中，分别接入不同添加量1.0%，2.0%，3.0%，4.0%，5.0%的植物乳杆菌ST-Ⅲ，在35 ℃下恒温发酵48 h，对其进行感官评分。

接种量对饮料感官评分的影响见图1。

图1 接种量对饮料感官评分的影响

由图1 可知，随着植物乳杆菌ST-Ⅲ接种量的增加，板栗复合发酵饮料的感官评分先上升后下降。当植物乳杆菌ST-Ⅲ接种量小于3%时，板栗复合发酵饮料口感风味偏甜，组织状态不均匀，且有分层现象。当接种量达到3%时，感官评分最高，为85 分。此时饮料色泽呈咖啡色，口感较为细腻、酸甜适中。当接种量高于3%时饮料口感偏酸，发酵风味过于浓厚，板栗红枣香味风味不协调。汪云阳等人[18]以枸杞原浆为原料，研究出当植物乳杆菌CGMCC8198 接种量为2%枸杞发酵饮料风味最佳。综合考查，试验选取接种量2%~4%为进一步优化范围。

2.1.2 发酵温度对板栗复合饮料发酵的影响

将3%植物乳杆菌ST-Ⅲ接入于板栗红枣汁中，分别在25，30，35，40，45 ℃条件下发酵48 h，对其进行感官评分。

发酵温度对饮料感官评分的影响见图2。

图2 发酵温度对饮料感官评分的影响

由图2 可知，随着发酵温度的升高，板栗复合饮料的感官评分呈现先上升后下降趋势。当发酵温度低于30 ℃时，板栗复合饮料组织状态基本稳定，板栗红枣香气混合均匀，口感略微粗糙，不顺滑；当发酵温度为30 ℃时，饮料中红枣和板栗的混合香味最佳，色泽较为均匀，口感细腻，酸甜可口，且感官评分最高，为91 分。发酵温度过低或过高均不利于植物乳杆菌ST-Ⅲ的生长，会导致发酵风味欠佳，色泽较浅，酸甜略有不适。综合考查，试验选取发酵温度25~33℃为进一步优化范围。

2.1.3 发酵时间对板栗复合饮料发酵的影响

将3%植物乳杆菌ST-Ⅲ接入于板栗红枣汁中，在30 ℃恒温条件下，分别发酵24，36，48，60，72 h，对其进行感官评分。

发酵时间对饮料感官评分的影响见图3。

图3 发酵时间对饮料感官评分的影响

由图3 可知，随着发酵时间继续延长，板栗复合饮料的感官评分出现先上升后急速下降。当发酵时间低于48 h 时，由于发酵时间不充分，饮料口感略甜，混合香气不协调，组织状态基本均匀；发酵时间为48 h 时感官评分高达93 分，此时产品口感细腻顺滑，板栗红枣的香气混和均匀，无异味，颜色均匀一致。当发酵时间大于48 h 时，发酵的饮料口感过酸，发酵味道过浓，产生不良的风味，色泽暗沉、组织状态不均匀。综合考查，试验选取发酵时间40~56 h 为进一步优化范围。

2.2 响应面试验结果与分析

2.2.1 Box- behnken 试验设计与结果

在单因素试验结果的基础上，以植物乳杆菌ST-Ⅲ的接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）为自变量，感官评分R为响应值，运用Design Expert 10.0 软件对板栗红枣饮料发酵工艺进行响应面设计优化。

响应面试验的设计与结果见表3，回归方程方差分析见表4。

表3 响应面试验的设计与结果

对表4 进行回归分析，得到的回归方程为[19-20]：

2.2.2 回归模型有效性及显著性

由表4 可知，回归模型F=69.10，模型极显著p<0.000 1，失拟项不显著p=0.062 4>0.050 0，模型合理。决定因素R2=0.988 9，模型能够反应响应值的变化，回归方程拟合良好。回归模型中的一次项与二次项极显著p<0.000 1，其对感官评分均有极显著影响。由F值可以判断出3 个考查因素对植物乳杆菌ST-Ⅲ板栗复合饮料感官评分结果影响的大小依次为发酵温度＞接种量＞发酵时间。

表4 回归方程方差分析

2.2.3 响应面因素交互作用分析

综合考查交互项对感官评分的影响，使3 个因素里的其中一个因素固定不变，选择其中任意2 个因素，观察对感官评分的影响。通过Design Expert 10.0 软件对表3 的数据进行拟合分析得到等高线图和响应曲面。

接种量和发酵温度对感官值影响的响应曲面及等高线图见图4。

图4 接种量和发酵温度对感官值影响的响应曲面及等高线图

由图4 可看出，植物乳杆菌ST-Ⅲ的发酵温度和发酵时间等高线图形为椭圆状，表明接种量和发酵温度2 个因素之间存在的交互作用较为显著，感官评分随着接种量和发酵温度的增大呈现先上升后下降的趋势。结合此响应面可以看出，发酵温度上升的幅度明显大于接种量的上升幅度，说明发酵温度对感官评分影响较大。

发酵温度和发酵时间对感官值影响的响应曲面及等高线图见图5。

图5 发酵温度和发酵时间对感官值影响的响应曲面及等高线图

由图5 可知，植物乳杆菌ST-Ⅲ的发酵温度和发酵时间等高线图形呈椭圆形状较明显，则发酵时间和发酵温度两因素之间存在着一定的交互作用。随着发酵时间和发酵温度的增加，感官评分呈现出先上升后下降的趋势，但发酵温度上升幅度明显大于发酵时间的上升幅度，说明发酵温度对感官评分影响较大。

接种量和发酵时间对感官值影响的响应曲面及等高线图见图6。

图6 接种量和发酵时间对感官值影响的响应曲面及等高线图

由图6 可知，植物乳杆菌ST-Ⅲ的接种量和发酵时间的等高线图呈椭圆状图形不明显，说明发酵时间和接种量两因素交互作用不显著。随着植物乳杆菌ST-Ⅲ接种量和发酵时间的增加感官评分先上升后下降，结合此响应面可看出，两因素上升的幅度相近，对感官评分影响相当。

由等高线图可明显看出，两因素之间的交互作用强弱，呈椭圆状表明两因素交互作用是否显著。

3 个因素之间的交互作用及对感官评分的影响和方差分析的结果一致，运用Design Expert10.0 软件得到该模型的极大值点，即植物乳杆菌ST-Ⅲ发酵板栗复合饮料的最佳工艺条件为接种量2.690%，发酵温度28.757 ℃，发酵时间48.446 h，得到最大感官评分数为95.077 分。为试验操作过程中的方便，调整优化发酵条件为接种量2.7%，发酵温度29 ℃，发酵时间48 h。将优化后的试验条件进行3 次验证试验，对其进行感官评价，得到的感官评分的平均值为94.4 分，与模型预测值误差0.71%，说明试验值与预测值吻和良好。因此，Box-behnken 设计的各个因素添加量的方案准确可靠，具有可操作性[21]。

2.3 理化指标与微生物指标

最佳发酵条件下得到的板栗红枣复合饮料中可溶性固形物含量12.5%，pH 值3.7，总酸质量浓度为10.236 g/L，菌落总数≤100 CFU/mL。

3 结论

以3∶1 的比例复配板栗汁和红枣汁，接入植物乳杆菌进行发酵，通过单因素试验及响应面优化法确定板栗复合饮料的最佳工艺条件为接种量2.7%，发酵温度29 ℃，发酵时间48 h。经过验证结果表明，在最优发酵条件下的感官评分为94.4 分，与模型预测数据误差值为0.71%。将饮料灌装后在高温条件下灭菌后冷却至室温，经观察无胀罐、无杂菌污染现象，即制得发酵板栗复合饮料成品。

试验的产品作为乳酸菌发酵型饮料的一种，其饮料特点是植物乳杆菌通过原料底物和发酵过程决定的。由于板栗淀粉含量较高，且不溶于水，试验在制作过程中没有做到原料中淀粉较好的利用。板栗果中淀粉的完全利用有待进一步研究。对于板栗发酵型饮料的稳定性，试验在稳定剂的选择上采用了柠檬酸单一稳定剂的添加，通过观察，板栗复合发酵饮料在静止放置24 h 后，没有明显的分层现象，但液面周围会出现挂壁现象，因此板栗复合饮料的稳定性还需进一步研究。