景鹤养心舒治疗慢性心力衰竭的作用机制*

胡华鹏，朱金燕，李杰平，赵星，刘明

1 云南中医药大学 云南昆明 650500

2 昆明市中医医院 云南昆明 650051

3 昭通卫生职业学院 云南昭通 657099

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是因心肌细胞缺血缺氧及血流动力学负荷过重等引起心肌细胞损害而导致心脏功能异常的一种心血管疾病，对患者生理、心理健康造成了很大影响[1]。据相关研究[2-5]，中国、美国、欧洲等各国CHF患者基数大，预后差，具有较高的致残率及致死率。目前治疗CHF取得了很大的进展，在改善CHF患者再住院率、死亡率及生活质量等方面有了很大的突破，但其临床疗效不能达到人们的预期[6]。

景鹤养心舒是云南省名中医刘明教授基于中医辨证论治的理论体系，结合多年的临床经验，在长期的临床实践中反复验证拟定，在治疗慢性心力衰竭取得了较好的临床疗效。为了深入探究景鹤养心舒治疗慢性心力衰竭的作用机制，拟通过网络药理学和分子对接从细胞及分子层面对该药进行剖析，为进一步开展具体的药理及机制研究提供一定的理论依据。

资料与方法

1 方药组成

景鹤养心舒组方：红景天、仙鹤草、葶苈子、桂枝、茯苓、丹参、甘草。

2 数据库与软件

TCMSP 数 据 库（https：//old.tcmsp-e.com/）；TCMID 数据库（http：//47.100.169.139/tcmid/）；Gene-Cards数据库（https：//www.genecards.org/）；Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org/）；SwissTargetPrediction数 据 库（http：//www.swisstargetprediction.ch/）；Dis-GeNET 数 据 库（https：//www.disgenet.org/）；venny图（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/）；STRING 数 据 库（https：//cn.string-db.org/）；DAVID Bioinformatics Resources数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）；PDB 数 据 库（https： / /www.rcsb.org /）； Cytoscape3.9.1软 件；Pymol软 件；Autodock软 件；Excel 2014软件。

3 方法

3.1 景鹤养心舒相关靶点筛选 检索TCMSP数据库，分别以“仙鹤草、葶苈子、桂枝、茯苓、丹参、甘草”为关键词，以药物类药性（DL）≥0.18和口服生物利用度（OB）≥30%为筛选条件[7]，得到景鹤养心舒中上述6味中药的有效成分及相关靶点的蛋白名称，再通过Uniprot数据库查找相应的“Homo sapiens”基因名称。以“HONG JING TIAN”为关键词在TCMID数据库中查找红景天的有效成分，再通过SwissTarget-Prediction数据库以Probability>0.02为筛选条件检索出相对的基因靶点。

3.2 CHF相关靶点筛选 检索GeneCards数据库、DisGeNET 数据库，以“chronic heart failure”为关键词搜索相关基因靶点，并通过venny图筛选出两个数据库中的相同基因靶点。

3.3 “药物-成分-靶点-疾病”网络图构建 使用venny图查找景鹤养心舒靶点与CHF靶点的交集，并筛选出景鹤养心舒中作用于该交集靶点的成分。将筛选出的成分与交集靶点一一对应并导入Cytoscape3.9.1软件中，构建景鹤养心舒有效成分与CHF靶点的关系图。

3.4 成分-疾病靶点PPI网络构建 为进一步研究景鹤养心舒治疗CHF的药理机制，本研究通过STRING在线平台输入景鹤养心舒和CHF的交集靶点，进行蛋白—蛋白相互作用分析，选取互作分数≥0.4。

3.5 景鹤养心舒成分-CHF靶点功能与通路的富集分析 为了说明靶蛋白在治疗CHF中的生物学过程、分子功能、细胞组成、通路分析及富集情况，进行GO富集分析和KEGG富集分析。将景鹤养心舒和CHF的交集靶点输入DAVID数据库，选择物种“Homo Sapiens”（P<0.05），进行富集分析。

3.6 核心活性成分与关键靶点的分子对接验证 为验证筛选出的核心成分作用于CHF潜在关键靶点的准确性，将“药物-成分-靶点-疾病”网络图筛选出的核心成分与PPI网络中得到的关键靶点进行分子对接。在 TCMSP 数据库中下载核心成分的2D 分子结构，从PDB数据库下载关键靶点3D结构，所得成分与靶点蛋白结构均导入Pymol软件进行脱水，并保存为pdb格式，再通过 Autodock 软件进行预处理及分子对接，运用Pymol软件进行输出优化。

结 果

1 景鹤养心舒有效成分的筛选及靶点预测

共筛选出景鹤养心舒中有效成分182个（其中红景天26个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后21个；仙鹤草5个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后5个；葶苈子12个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后9个；桂枝7个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后6个；茯苓15个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后6个；丹参65个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后59个；甘草92个，去除无靶点以及无人源靶点化合物后85个。共191个，删除重复项后共182个），对应基因靶点共3380个，删除重复项后共499个。

2 CHF相关靶点的获取

GeneCards数据库中共检索出CHF基因靶点10596个，DisGeNET数据库中共检索出CHF靶点223个，通过venny图筛选出相同靶点199个。

3 药物-成分-靶点-疾病网络图的构建

通过venny图，景鹤养心舒作用靶点与CHF相关靶点交集42个，见图1，可视化分析见表1，这些即为景鹤养心舒作用于CHF所涉及的靶点。选出景鹤养心舒中能够作用于这42个靶点的有效成分，共有红景天16种、仙鹤草4种、葶苈子7种、茯苓4种、桂枝3种、丹参44种，甘草73种，景鹤养心舒治疗CHF的有效成分共142种。景鹤养心舒“药物-有效成分-靶点-疾病”关系见图2，可视化结果显示，景鹤养心舒有效成分中Quercetin（槲皮苷）和Kaempferol（山奈酚）的出度较高，见表2，作用靶点中诱导型一氧化氮合酶和二肽基肽酶4的入度较高，见表2，表3。

表1 景鹤养心舒化合物靶点与CHF相关靶点共有交集

表2 出度最高的5种有效成分

表3 入度最高的5个靶点基因

图1 景鹤养心舒靶点与CHF靶点关系

图2 “中药-疾病-有效成分-靶点”网络

4 蛋白质－蛋白质相互作用（PPI）网络

通过STRING数据库，得到景鹤养心舒42个靶点基因间相互作用，利用Cytoscape绘制蛋白—蛋白互作（PPI）网络图，见图3，可视化分析后自由度最高的5种分别为 IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE，见表4。

图3 PPI网络Cytoscape

表4 自由度最高的5种靶基因

5 靶点功能与通路的富集分析

GO功能富集分析得到768个条目（P<0.05），其中生物过程273个、分子功能35个、细胞成分22个，3个部分各取前10个条目建立柱状图，见图4。柱状图显示，生物学过程包括细胞因子介导的信号通路、缺氧反应、基因表达的正调控、炎症反应、G蛋白偶联受体信号通路、药物反应、凋亡过程的正调控、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、基因表达的负调控、细胞增殖的正调控。细胞组分有质膜、膜的组成部分、质膜的组成部分、细胞外间隙、细胞外区、膜、内质网、内质网膜、厄尔表面、突触前膜的内胚层成分。分子功能涉及蛋白质结合、相同蛋白结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白质异二聚活性、酶结合、G蛋白偶联受体活性、锌离子结合、细胞因子活性、转录因子结合、大分子复合物结合。

图4 景鹤养心舒治疗CHF GO富集分析

KEGG通路富集分析得到60个条目（P<0.05），选择前20个条目建立气泡图，见图5。这些通路包括流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路、钙信号通路、脂质与动脉粥样硬化通路、HIF-1信号通路、代谢途径、cGMP-PKG信号通路、糖尿病心肌病、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、AGERAGE信号通路、松弛素信号通路等，通过气泡图也可以看出流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、AGERAGE信号通路为最重要两条通路。

图5 景鹤养心舒治疗CHF KEGG富集分析气泡

6 核心活性成分与关键靶点的分子对接验证

以筛选出的5种核心成分与5种关键靶点进行分子对接，结果分子对接所得结合能均小于-5，提示核心活性成分与靶点均具有较好的结合活性，分子对接结果见表4，其中β-谷甾醇与NOS3、β-谷甾醇与ACE、山奈酚与ACE结合力较为显著，见图6。

图6 对接结果示意

表4 核心活性成分与关键靶点对接结合能

讨 论

本研究系统分析了景鹤养心舒的活性成分及其治疗CHF的作用靶点，通过构建“中药－疾病－有效成分－靶点”关系图，可推测槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、异鼠李素这5种成分可能是景鹤养心舒治疗CHF的最重要化学物质，诱导型一氧化氮合酶（NOS2）、二肽基肽酶 4（DPP4）、β-2 肾上腺素受体（ADRB2）、毒蕈碱乙酰胆碱受体M3（CHRM3）、Mu型阿片受体（OPRM1）靶点是景鹤养心舒作用于CHF最主要的靶点。槲皮苷是一种黄酮类单体化合物，可抑制促进细胞凋亡和心脏肥大的钙调蛋白磷酸酶的活性，可抑制炎症反应，抵制细胞发生氧化应激[8-9]。山奈酚属于黄酮类化合物，能促进缺氧心肌细胞增殖、降低活性氧水平、抑制缺氧心肌细胞凋亡和抑制自噬，也有抗炎的作用[10]。木犀草素是属于黄酮类化合物，能抗氧化应激及抑制炎症反应，抑制心肌细胞线粒体损伤，抑制外周血淋巴细胞DNA损伤[11-12]。β-谷甾醇是一种天然多酚羟酸类化合物，能缓解氧化应激损伤，改善炎症反应，也可通过下调ERK1/2信号通路，上调Bcl-2/Bax信号通路，抑制心肌细胞凋亡[13]。异鼠李素是一种植物类黄酮，通过抑制心肌细胞线粒体的调亡，从而阻止细胞自噬的发生[14]。DPP4可作用于干细胞，调控心肌细胞的再生；可作用于心肌胶原纤维表达；与炎症细胞浸润、细胞因子产生相关[15-16]。ADRB2对正常心肌细胞无太大影响，心衰细胞中的ADRB2的增加导致环磷酸腺苷的区域化，来促进心肌细胞的存活，增强心肌细胞抗损伤、抗缺血和缺氧能力，除此以外，ADRB2在确保心衰细胞存活率的基础上增加心肌细胞的收缩幅度[17]。NOS2、CHRM3、OPRM1作为CHF的靶点，也是景鹤养心舒治疗CHF的主要靶点之一，目前文献中暂未发现对心血管方面的确切研究。

通过PPI网络结果可看出白细胞介素-6（IL6）、肿瘤坏死因子（TNF）、内皮型一氧化氮合成酶（NOS3）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、血清血管紧张素转化酶（ACE）是景鹤养心舒作用于CHF的关键靶点。TNF、IL6均作为重要的炎症因子，通过刺激促炎白细胞的募集，促进心肌损伤、纤维化重塑和功能障碍已广泛参与心力衰竭的发病机制[18]。NOS3主要存在于血管内皮细胞，在催化剂的催化下可生成内皮细胞衍生性一氧化氮，进而引起鸟苷酸环化酶激活积聚，游离Ca2+减少，最终导致平滑肌细胞松弛、血管扩张[19]。VEGFA是调节血管功能的关键因子，能够与血管内皮细胞上的相关受体结合，发挥促进新生血管形成等功能[20]。ACE与血管的收缩扩张功能密切相关，2018中国心力衰竭诊断和治疗指南提出所有射血分数降低型心力衰竭患者均应使用ACE拮抗剂[21]。

从GO富集分析得出景鹤养心舒作用于CHF的生物学过程主要涉及炎症反应、缺氧反应、基因表达的正负调控、细胞增殖的正调控、调亡过程的正调控、药物反应等。细胞组分包括质膜、膜的组成部分、质膜的组成部分、细胞外间隙、细胞外区、内质网、内质网膜、厄尔表面、突触前膜的内胚层成分等。分子功能涉及相同蛋白结合、蛋白质同源二聚化活性、蛋白质异二聚活性、酶结合、G蛋白偶联受体活性、锌离子结合、细胞因子活性、转录因子结合、大分子复合物结合等。

通过KEGG富集分析可知景鹤养心舒治疗CHF的信号通路主要涉及以上所述20种通路，流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路为景鹤养心舒治疗CHF的主要通路。其中流体剪切应力与动脉粥样硬化均可影响血管内皮细胞功能，进而影响到NO的产生及炎症因子的释放[22]。AGERAGE信号通路可通过其对动脉僵硬度、动脉粥样硬化、线粒体功能障碍、氧化应激、钙稳态和细胞骨架功能的影响来调节CHF的发病机制[23]。此外，HIF-1信号通路主要涉及涉及活性氧的产生[24]。cGMPPKG信号通路可控制各种心肌特性，包括细胞生长和存活、间质纤维化、内皮通透性、心肌收缩力和心血管重塑[25]。糖尿病心肌病的途径主要表现在心肌细胞的氧化应激、炎症、调亡和神经体液机制等方面[26]。PI3K-Akt信号通路通过改变呼吸链终端酶细胞色素C氧化酶的活性来保护线粒体的功能，进而阻止细胞调亡[27]。压力超负荷可引起心肌细胞内cAMP浓度升高，同时，cAMP表达减少会导致Ca2+的转运异常，从而导致心肌的舒缩功能障碍[28-29]。

最后，分子对接结果显示了景鹤养心舒中的核心成分与该药治疗CHF的关键靶点之间有良好的对接，其中β-谷甾醇与NOS3、β-谷甾醇与ACE、山奈酚与ACE结合力较为显著。

结 论

综上所述，景鹤养心舒治疗CHF作用机制可能是该药中槲皮苷、山奈酚、木犀草素、β-谷甾醇、异鼠李素这5种核心成分作用于IL6、TNF、NOS3、VEGFA、ACE等关键靶点，通过流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、AGE-RAGE信号通路等通路发挥抑制心脏重塑、延缓心肌细胞凋亡、调节氧化应激、影响炎性因子、改善心脏收缩舒张功能、减轻心脏后负荷等作用。但由于中药组方的复杂性，景鹤养心舒治疗CHF是否通过上述机制发挥作用还需后续的基础试验进一步验证。