两个侧耳科真菌的形态学及ITS鉴定

田慧敏 王秀艳 吕国帅 曹 蝶 刘 爽

（赤峰学院生命科学学院，内蒙古赤峰 024000）

侧耳属Pleurotus（Fr.）P.Kumm.建属于1871 年，最初隶属于担子菌门（Basidiomycotina）、伞菌目（Agaricales）、口 蘑 科Tricholomataceae[1]。1951 年Singer 在研究多孔菌相关属的子实层髓时指出香菇属Lentinus、革耳属Panus、侧耳属Pleurotus应归为多孔菌科[2]。1980年Kühner将该属从多孔菌科分离出来独立成侧耳科Pleurotaceae Kühner[3]。《菌物字典》第10版的分类系统，侧耳属隶属于侧耳科（Pleurotaceae），该科包括侧耳属Pleurotus、亚侧耳属Hohenbuehelia等[4]。该科真菌一般木生，多为掌状或扇状的担子果，菌褶延生，色浅，常白色；菌柄侧生、偏生、中生或无柄，孢子印白色，担孢子无色，长椭圆形或腊肠形。据统计，我国现有侧耳科真菌52种，其中侧耳属36 个种、5 个变种，亚侧耳属11 个种[5-6]。该科真菌多数种类具有重要的经济价值或药用价值，在我国的栽培面积较广。据统计，2019年我国侧耳类食用菌的产量达600 万t[7]，并逐年上升，主要栽培种有糙皮侧耳Pleurotus ostreatus（Jacq.）P.Kumm.、肺形侧耳（凤尾菇）P.pulmonarius（Fr.）Quél.、金顶侧耳P.CitrinopileatusSinger、囊状侧耳P.cystidiosusO.K.Mill.，扇形侧耳P.flabellatusSacc.、美味侧耳P.SapidusQuél.和阿魏侧耳P.eryngiivar.Ferulae（Lanzi）Sacc.等。部分侧耳属真菌可以专性产毒，在防治线虫中具有重要应用价值[8-11]。同时侧耳科真菌多数为木腐菌，有利于维持生态平衡，促进环境修复[12-13]。根据真菌索引统计，侧耳科真菌有900 多种（包括变种、亚种等），其中侧耳属758 种，亚侧耳属192 种[14]，而我国仅有50 余种。笔者对采自内蒙古自治区赛罕乌拉自然保护区桦树上的2 个野生侧耳菌株采用形态学与ITS 测序相结合的方法进行分类鉴定，为食用菌品种的鉴别、菌种的纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试标本来源

供试标本CFSZ 10112和CFSZ 10286由刘铁志、田慧敏、赵艳龙、万威、吴晶等于2013年8月15日采自内蒙古赤峰市巴林右旗赛罕乌拉国家级自然保护区（东经118°18'～118°55'，北纬43°59'～44°27'），同时拍摄彩色生境照片，晾干后制成干标本存放于赤峰学院菌物标本室（CFSZ）。

1.2 形态鉴定

观察新鲜子实体形状、颜色、附属物、菌褶着生方式、菌柄等并测量其大小，颜色主要依据采集时拍摄的彩色照片判断；宏观特征以观察2 个以上子实体为依据，显微结构观察担孢子、担子、囊状体、子实层菌丝，菌盖表皮菌丝等结构。孢子大小以不同孢子的长宽范围为依据，将标本的菌褶、菌盖表皮等组织做成徒手切片（通常以4%～5%KOH 溶液作为浮载剂）。孢子测量25～30 个，其他结构测量10～20 个，然后进行形态学分类鉴定，用显微照相系统（Olympus BX53）拍摄显微结构。

1.3 ITS测序鉴定

1.3.1 基因组DNA的提取、PCR扩增及测序

干品子实体菌盖部分经研磨称量30 mg 后，按照参考文献[15]完成PCR 扩增反应，正向引物和反向引物为ITS1/ITS4 引物[16]。PCR 扩增产物经Takara胶纯化试剂盒（大连宝生物工程有限公司）纯化回收后委托上海生工生物科技有限公司完成测序。

1.3.2 ITS序列比较和系统发育分析

将已测序列在GenBank 和UNITE 数据库中进行Blast 比对，从结果中挑选出同源性较高的ITS 序列，采用软件MEGA5.1构建发育树，比较亲缘关系，构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定结果

经形态学鉴定，CFSZ10112 为肺形侧耳Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.，CFSZ10286 为暗蓝亚侧耳Hohenbuehelia atrocoerulea（Fr.）Singer。

2.1.1 CFSZ10112标本特征

担子果丛生，菌盖直径为1.8～7.0 cm，扇形（肾形、倒卵形），不黏，灰白色、白色或米白色；边缘色浅，表面光滑，边缘有时稍内卷，成熟后呈波浪状。菌褶白色，延生，不等长，干后米白色。菌柄短或无，（0.6～2.0）cm ×（1.0～1.5）cm，侧生，白色；基部有白色短绒毛（图1a）。

孢 子（7.5～10.0）µm×（3.0～5.0）µm，（Q=1.95～2.77，Q=2.53±0.39），长椭圆形或圆柱形，常有小尖，光滑，无色，非淀粉质（图1b、d）。担子（19.2～29）µm×（5.0～7.2µm），棒状，4 个小梗，较细，长2.5～4.0µm，梗径小于0.5µm，无色（图1c），担子基部具锁状联合。菌丝直径5.0～8.4µm，无色透明，薄壁，具隔膜，锁状联合多（图1d），菌髓菌丝不规则排列。菌盖表皮由无色菌丝组成，薄壁，分枝多，具较多锁状联合，似菌褶菌丝，菌丝直径4.8～7.2µm（图1e），菌盖菌丝无色。菌柄表皮有排列整齐的无色菌丝组成。

图1 CFSZ10112标本子实体形态及微观结构

2.1.2 CFSZ10286标本特征

担子果叠生，菌盖直径为1.7～2.6 cm，扇形（半圆形、肾形），表面黄褐色、深棕色至灰棕色，边缘色浅（黄棕色），表面密被灰褐色、暗棕绿色短绒毛，盖缘处绒毛少，边缘内卷或波浪状（图2a），菌褶白色，干后米白色，稀，每毫米2～3 片，延生，不等长；菌柄无，菌褶延伸至假菌柄，长度0.5～1.0 cm（图2b）。菌肉白，两层，上层为灰色，下层为白色菌肉，孢子印白色。

担孢子（5.7～8.2）µm×（3.1～4.6）µm，（Q=1.95～2.77，Q=2.53±0.39），长椭圆形，腊肠形，有小尖，光滑，无色，非淀粉质（图2c）；担子（14.6～45.6）µm×（4～5.3）µm，棒状，四个小梗，担子基部未见锁状联合，褶侧囊状体多，（31.5～67.2）µm×（10.0～12.5）µm，壁厚，梭形、纺锤形或腹鼓形，有的顶端具有无色透明颗粒状结晶帽状结构（图2d、e）。褶缘囊体棒状，（19～35）µm×（5.5～8.0）µm，子实层菌丝无色透明，壁薄，具隔膜，具锁状联合且多，5.0～8.4µm（图2f），菌髓菌丝凝胶化，无色，具锁状联合。菌盖表皮由顶端浅黄色菌丝组成，密集处呈棕色，菌丝直径为4.8～6.2µm，壁薄，无色，有隔膜，顶端钝圆，渐变窄（图2g）；菌柄表皮有排列整齐的无色菌丝组成。

图2 CFSZ10286标本子实体形态及微观结构

2.2 rDNA-ITS测序鉴定结果

经检测CFSZ10112 长度为676 bp（登录号为KR086878、KR086879）；CFSZ10286 为667 bp（登录号为KR082882）。

2.3 系统发育分析

以Tricholoma matsutake作为外群，对CFSZ 10286、CFSZ 10112 两个标本的ITS 序列及相似序列等21 个ITS 序列构建系统发育树（图3）。结果聚为三类，第一组为侧耳属Pleurotus，第二组为亚侧耳属Hohenbuehelia，第三组为扇菇属Panellus、小香菇属Lentinellus，CFSZ10112与P.pulmonarius（Fr.）Quél.及Lentinus sajor-caju（Fr.）Fr.聚为一类，CFSZ 10286与H.reniformis（G.Mey.）Singer、H.grisea（Peck）Singer、H.atrocoerulea（Fr.）Singer 聚为一类，结合形态特征将CFSZ10112 鉴 定 为肺 形 侧 耳P.pulmonarius（Fr.）Quél.，CFSZ 10286 鉴定为暗蓝亚侧耳H.atrocoerulea（Fr.）Singer。

表1 与供试侧耳2个标本ITS序列相似的序列

图3 供试标本及来自Genbank的最相似物种的ITS序列的NJ系统发育树

3 小结

CFSZ10112 与 糙 皮 侧 耳P.ostreatus（Jacq.）P.Kumm.、白侧耳P.albellus形态上相似，但糙皮侧耳子实体覆瓦状叠生，浅灰色，褐灰色，而该标本菌盖灰白色或米白色，白侧耳P.albellus具有较大白色或米白色菌盖，最大直径可达11 cm[5，17]，但供试标本菌盖颜色浅黄褐色或肉色。分子水平分析结果，肺形侧耳Pleurotus pulmonarius与Lentinus sajor-caju相似度为99%以上，而L.sajor_caju、P.sajor_caju与P.pulmonarius是同物异名[18]，是同一种，因此将CFSZ10112鉴定为肺形侧耳Pleurotus pulmonarius（Fr.）Quél.。

分子水平分析表明，标本CFSZ 10286 与H.reniformis（G.Mey.）Singer、H.grisea（Peck）Singer、H.atrocoerulea（Fr.）Singer相似度高（99%），较难区分，而H.grisea有长1.0～1.5 cm 的菌柄，有较多结晶的盖囊体[5，19]，CFSZ 10286 无此特征。H.reniformis菌盖被白色或灰白色细绒毛，孢子较大（10～14）µm ×（5～6）µm[5]，而CFSZ 10286 菌盖被灰褐色、暗棕绿色短绒毛，孢子（5.7～8.2）µm×（3.1～4.6）µm，综合其他特征将CFSZ 10286 鉴定为暗蓝亚侧耳H.atrocoerulea（Fr.）Singer；该种可食，同时含有灰侧耳素，具有抗菌作用，对线虫具有防治效果[5，20]，具有潜在经济价值，我国仅分布于海南省，为内蒙古新记录种。

研究结果为我国侧耳科真菌的分布及资源现状做了重要补充，对我国菌物资源生物多样性研究和可食用菌开发利用提供依据。