高效液相色谱—串联质谱法测定猪可食性组织中烯丙孕素残留

倪香艳 孙念霞 于寒冰 方 芳 孙志文

(1. 北京市农产品质量安全中心,北京 102629；2. 安徽中医药大学,安徽 合肥 230012)

烯丙孕素是一种人工合成的甾类促孕孕酮[1-2]。临床上欧盟和美国已批准将烯丙孕素用于对猪和马的同期发情的调控[3]，其作用机理是通过与黄体酮的受体结合，抑制机体内促性腺相关激素的生成[4]，降低其在血浆中的浓度，进而调控母畜发情周期[5]。非洲猪瘟背景下，种猪的繁殖性能是育种成功的关键所在，作为人工合成的甾类促孕孕酮的烯丙孕素在中国母猪批次化生产过程中，也成为应用最为广泛的外源性孕激素之一[5-6]。但动物试验表明孕激素会增加死胎率，且有致畸作用[7]，人体长期摄入烯丙孕素药物超标的动物产品会破坏机体内激素平衡，引起癌变，还会导致婴幼儿身体发育异常[8-9]。为避免烯丙孕素在动物可食性组织中的残留，农业农村部规定烯丙孕素在猪肌肉、肝脏、脂肪中的最高残留限量(试行)分别为1，2，4 μg/kg。

目前有关孕激素等激素类药物残留的检测方法有液相色谱法[9-10]、气相色谱—串联质谱法[11]、液相色谱—串联质谱法[12-13]等。液相色谱法的抗干扰能力较差、灵敏度低[10]；气相色谱法样品需衍生化，不适用于激素类等挥发性较低的药物检测[11]；高效液相色谱—串联质谱方法具有特异性强、灵敏度高等优点[13]，已成为兽药残留痕量药物检测的发展趋势。目前国内外有关烯丙孕素药物的研究主要集中于其对母猪发情性能的影响机理等方面[3]，对其在动物体内的残留检测关注度较少且仅限于肌肉、饲料、肝脏等单一组织[3,14]，未见有肌肉、肝脏、脂肪等多个靶组织同时检测的多残留分析方法；部分检测方法存在前处理过程中未进行酶解导致定量不准确、提取液未净化[14]导致仪器污染等问题。研究拟建立一种猪肌肉、肝脏、脂肪中烯丙孕素药物残留检测的高效液相色谱—串联质谱方法，采用多种水解酶进行酶解、乙腈提取猪组织中残留的烯丙孕素，旨在为猪可食性组织中烯丙孕素残留分析检测提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

烯丙孕素标准品：纯度≥98.0%，德国Dr. Ehrenstorfer 公司；

β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶：>10 000 U/mL，美国Sigma公司；

乙腈、甲酸：质谱级，德国Merck公司；

PRiME HLB固相萃取柱：200 mg，6 mL，美国Waters公司；

乙酸钠、氯化钠：分析纯，北京化工厂。

1.1.2 主要仪器设备

高效液相色谱—串联质谱仪：Waters Xevo TQ-S型，配备MassLynx V4.1软件处理系统，美国Waters公司；

电子天平：BSA6202S型，上海诺萱科学仪器有限公司；

高速冷冻离心机：CR30NX型，德国Eppendorf公司；

氮吹仪：TTL-DCII型，上海标卓科技仪器有限公司；

旋涡振荡器：Vortex 3000 Elite型，维根技术北京有限公司。

波纹管作为一种新型强化换热技术，在各个领域中有广泛的应用。采用Fluent模拟了3种不同波形度的波纹管流动，从速度分布、压力分布、涡结构3个方面研究波纹管的流动特性，并与光滑管模拟结果进行对比，得出如下结论：

1.2 方法

1.2.1 样品前处理 称取匀浆后猪肌肉、肝脏、脂肪样品(2.00±0.01) g，依次加入8 mL乙酸钠缓冲溶液(0.2 mol/L，pH 5.2)、20 μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，涡旋混匀2 min，55 ℃振荡酶解2 h。分别加入3 g 氯化钠、10 mL乙腈溶液，涡旋混匀10 min，8 000 r/min离心5 min。上清液于-20 ℃冷冻除脂20 min，冷冻后提取液于-4 ℃、8 000 r/min离心5 min，弃去脂肪层。取5 mL提取液直接过PRiME HLB固相萃取柱，洗脱液直接收集于离心管中，45 ℃氮吹至干，加入0.5 mL 20%乙腈水溶液溶解，上清液过0.22 μm滤膜，净化后复溶液供仪器检测分析。

1.2.2 液相色谱条件 色谱柱为Waters UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm)，填料粒径1.7 μm；流动相A为乙腈溶液，流动相B为0.1%甲酸水溶液，按表1进行梯度洗脱；流速0.3 mL/min；上样体积10 μL；柱温30 ℃。

表1 烯丙孕素高效液相色谱梯度洗脱条件

1.2.3 质谱条件 参照李建等[14]的方法。电喷雾正离子源；MRM质谱多反应监测信号采集方式；毛细管电离电压3.00 kV；源温度150 ℃；脱溶剂温度400 ℃；锥孔气流速150 L/h；脱溶剂气流速700 L/h。

1.2.4 标准曲线的制备 空白阴性样品按1.2.1处理得空白样品提取液，稀释标准品，得到系列基质匹配标准溶液，以待测药物浓度作为横坐标，对应的药物峰面积作为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.5 检测限和定量限 在空白阴性试验样品中添加待测药物，按1.2.1处理后进行分析。按照待测药物色谱峰信号响应的信噪比S/N>3确定检测限；S/N>10确定定量限。

1.2.6 准确度和精密度 在空白阴性试验样品中添加待测药物，对试验方法开展方法学考察。空白样品中添加水平为1.0，2.0，10.0 μg/kg药物，每个药物水平设5个重复，连续测定3 d，根据检测结果计算待测药物的回收率、日内变异系数和日间变异系数等。

2 结果与分析

2.1 前处理条件优化

2.1.1 提取条件 烯丙孕素药物多以与硫酸和葡萄糖醛酸结合形成结合型的轭合物形态存在[15]。试验采用β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶进行酶解，药物检测过程中将其结合态水解成游离形式的化合物进行测定。考虑到提取效率和安全等因素，选用乙腈作为前处理提取试剂。由图1可知，10，15 mL 乙腈对烯丙孕素提取的回收率接近且高于5 mL乙腈的，因此采用10 mL乙腈提取液对药物进行提取。

图1 乙腈提取体积对药物回收率的影响Figure 1 Effects on sample recovery of acetonitrile extraction volume

2.1.2 净化方式 待测样品中的杂质主要有蛋白质、脂类物质和一些小分子的极性物质[16]。蛋白质等大分子杂质、小分子极性物质等在有机溶剂提取药物过程中可以有效去除，脂类等大分子物质可以通过正己烷去除或者在低温冷冻下除脂。而烯丙孕素药物的极性较小，在正己烷中会有一定的溶解性[17]，因此采用低温冷冻去除脂类，使提取液的净化效果能够满足要求[18]。

由图2可知，HLB、C18固相萃取柱需活化，过程较繁琐且对待测物质吸附强，药物损失较大；PRiME HLB固相萃取柱处理样品方便、简单，不需要活化固相萃取柱，提取液直接流经固相萃取柱后进行浓缩、复溶即可检测，极大提升了样品前处理效率。

图2 净化方式对回收率的影响Figure 2 Effect on recovery of purification methods

2.2 色谱条件优化

激素类药物分离多采用C18反相色谱柱[19-20]，研究选用柱长为50 mm，柱内径为2.1 mm，粒度为1.7 μm的色谱柱时，色谱柱对待测组分与干扰杂质间的分离效果能满足检测要求。由图3可知，流动相采用乙腈-0.1%甲酸水进行梯度洗脱时，色谱峰型好，信号响应高，烯丙孕素能有效分离。

a1、a2为子离子MRM色谱图；a3为总离子MRM色谱图

2.3 质谱条件优化

试验表明，在负离子模式下直接进样进行测定，采集到的烯丙孕素母离子信号响应值较低；在正离子模式下直接进样进行测定，烯丙孕素母离子信号响应良好。故试验在酸性条件下进行，采用正离子模式电离检测待测药物。由表2可知，全扫描得到的准分子离子峰([M+H]+)为311.2。调节毛细管电压，使其丰度最大，进行二级质谱分析，优化毛细管电压、脱溶剂气流速及碰撞能量，进行子离子扫描，选择响应最高的两个离子碎片为待测药物定量离子和定性离子，最佳质谱参数条件：定量离子对311.2>227.2，锥孔电压22 V，碰撞电压24 V；定性离子对311.2>269.2，锥孔电压22 V，碰撞电压18 V。

2.4 方法学考察

2.4.1 基质效应 试验表明，烯丙孕素在猪可食用性组织中存在较强的基质抑制效应，故采用基质匹配标准溶液来消除基质效应。

2.4.2 线性范围 由表2可知，烯丙孕素在1～50 μg/L的质量浓度范围内线性良好，相关系数R2在0.99以上。

表2 不同基质烯丙孕素线性方程

2.4.3 检测方法灵敏度 由图4可知，在对应的保留时间内，空白试样中基质对待测药物无明显干扰。

当猪可食性组织中烯丙孕素添加量为0.5，1.0 μg/kg时，信噪比>3，当烯丙孕素添加量为1.0 μg/kg时，信噪比>10。因此，烯丙孕素检测限(LOD)为0.5 μg/kg，定量限(LOQ)为1.0 μg/kg。

b1、b2为子离子MRM色谱图;b3为总离子MRM色谱图

2.4.4 检测方法准确度和精密度 选取阴性肌肉、肝脏、脂肪样品进行添加回收试验，以肝脏组织为例，烯丙孕素添加离子色谱图如图5所示，方法学考察该方法的准确度和精密度。由表3可知，3个添加水平下，平均回收率为68.9%～87.4%；日内变异系数为0.8%～7.1%，日间变异系数为2.5%～11.6%，方法回收率及精密度满足残留检测要求。

表3 烯丙孕素不同添加量猪可食性组织中的回收率和变异系数

c1、c2、d1、d2、e1、e2为子离子MRM色谱图;c3、d3、e3为总离子MRM色谱图

3 结论

试验建立了一种快速检测猪肌肉、肝脏、脂肪多种可食性组织中烯丙孕素药物残留检测的高效液相色谱—串联质谱方法。结果表明，试验方法的前处理过程快速准确，净化效果显著且对仪器无污染。该方法线性关系良好，灵敏度高，重现性好，适用于猪肌肉、肝脏、脂肪多种组织中烯丙孕素残留批量快速检测。但试验未对更多的样品中烯丙孕素残留量进行测定，今后可以进一步对各个环节中样品进行药物含量测定和分析，有利于今后开展畜禽产品中孕激素的风险评估数据积累。