芹菜素抗乳腺癌作用及机制的研究进展

林沈国 毛怡雯 赵亚新

芹菜素又称芹黄素、洋芹素，广泛分布于自然界中，是一种主要来源于伞形科植物的小分子黄酮类化合物，也来源于其他植物科属、水果和蔬菜，尤以芹菜中含量为高。它通常以糖苷的形式存在于食物中，这可以提高其溶解度和生物利用度。理化性质上，芹菜素是一种黄色结晶性粉末，难溶于水，可溶于二甲基亚矾和热乙醇等，其分子式为C15H15O5[1]。作为一种特殊的天然化合物，芹菜素的毒性很低，具有潜在的抗氧化、抗炎、抗病毒和抗癌特性[2]。乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率分别位列我国女性恶性肿瘤的第1位和第4位。2015年我国女性乳腺癌新发病例约30.4万例，占女性全部恶性肿瘤发病的17.1%；死亡病例约7.0万例，占女性全部恶性肿瘤死亡的8.2%[3-4]。芹菜素作为一种天然的黄酮类化合物，用于治疗乳腺癌时具有抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡和分化、增强化疗药物敏感性和减轻耐药性等作用。本文就芹菜素抗乳腺癌作用及机制的研究进展作一综述。

1 芹菜素通过不同机制抑制乳腺癌细胞增殖

芹菜素可抑制不同乳腺癌细胞系的细胞增殖。孙晓力等[5]研究发现芹菜素80、160 μmol/L处理组的乳腺癌MDA-MB-231细胞24、48 h后生长均受到明显抑制，且 160 μmol/L处理组比80 μmol/L处理组更明显。Tseng等[6]研究发现非凋亡诱导浓度的芹菜素能抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞的增殖。Seo等[7]研究发现芹菜素能抑制乳腺癌SKBR3细胞的增殖，并呈剂量依赖性和时间依赖性。这种生长抑制伴随着亚G0/G1细胞凋亡数量的增加。Scherbakov等[8]报道芹菜素是最有效的植物雌激素，它能强烈抑制乳腺癌细胞的生长增殖，包括人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）阳性细胞。Choi等[9]研究将1～100 mmol/L芹菜素作用于乳腺癌SKBR-3细胞24、48和72 h后的抗增殖作用，当芹菜素浓度超过50 mmol/L时，无论暴露时间长短，都能显著抑制细胞增殖。

1.1 通过调控细胞周期抑制细胞增殖 细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，共有两个阶段，分别为间期与分裂期。细胞周期蛋白可周期性浓度升降，与真核细胞的细胞周期同步。它种类繁多，包括细胞周期蛋白（Cyclin）A、B、D、E、G及H等。它们可与关键的细胞周期蛋白依赖性激酶结合，并使酶活性得到调节，从而推动和协调细胞周期的正常运行。Tseng等[6]研究发现芹菜素抑制Cyclin A、Cyclin B和细胞周期蛋白依赖性激酶1的表达，这些蛋白控制细胞周期中G2～M期的转变。Shendge等[10]研究发现芹菜素在G2/M期阻滞乳腺癌MCF-7细胞，然后是剂量依赖性的凋亡。芹菜素可诱导乳腺癌MCF-7细胞内活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS），通过调控p53和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，Caspase）级联信号通路，诱导G2/M期细胞周期阻滞，进而诱导细胞凋亡。Pham等[11]研究发现芹菜素通过降低叉头盒蛋白M1（recombinant forkhead box protein M1，FOXM1）这一参与细胞周期的关键转录因子的表达来抑制细胞增殖。Choi等[9]研究发现50和100 mmol/L芹菜素高浓度处理乳腺癌SK-BR-3细胞48 h后，细胞周期明显阻滞在G2/M期。处理该细胞72 h，芹菜素使Cyclin D和Cyclin E的表达略有下降。此外，芹菜素诱导累积的G2/M期细胞群会引起Cyclin A和Cyclin B的减少。p21（WAF1/CIP1）基因是一个细胞周期调控基因，其蛋白是一细胞周期素依赖激酶抑制蛋白，可参与细胞生长、分化、衰老等活动。Tseng等[6]研究发现芹菜素上调p21，并增加了p21启动子区域组蛋白H3的乙酰化，导致p21转录的增加，抑制细胞周期进展。

1.2 通过调控抑癌基因表达抑制细胞增殖 芹菜素可通过调控抑癌基因的表达来抑制乳腺癌细胞增殖。相关研究表明芹菜素可诱导p53基因的表达增加，进而抑制乳腺癌细胞的增殖[9-10，12-13]。其中金雪瑛等[13]发现芹菜素可通过抑制缺氧诱导因子1α和磷酸化蛋白激酶B基因的表达来诱导p53基因的表达。

1.3 通过抗雌激素抑制细胞增殖 芹菜素可通过抗雌激素作用来抑制乳腺癌细胞增殖。Pham等[11]研究发现过度表达丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）的MCF-7细胞的增殖部分不依赖于雌二醇,并表现出对抗雌激素剂4-羟基他莫昔芬的不完全反应，表明这些细胞对雌激素治疗的抗性。Lecomte等[14]研究发现在雌二醇存在的条件下，芹菜素对乳腺癌细胞系MCF-7和T47D增殖具有拮抗作用，而在雌二醇不存在的情况下，对乳腺癌细胞表现出部分的弱促增殖作用。Scherbakov等[8]研究发现大剂量的芹菜素（50 μmol/L）具有抗雌激素样活性，可抑制雌二醇对雌激素受体的激活。Long等[15]研究发现芹菜素通过雌激素受体依赖性和非依赖性机制抑制抗雌激素耐药性乳腺癌细胞的生长。

2 芹菜素诱导乳腺癌细胞的凋亡与自噬

细胞凋亡是在基因调控下所发生的有规律的一系列细胞主动死亡的过程，通常发生在发育和衰老过程中，以确保细胞形成率和细胞死亡率之间的平衡，是维持机体组织中细胞数量的一种稳态机制[16]。Seo等[7]研究发现芹菜素增强了SKBR3细胞中切割的Caspase-8和Caspase-3的表达水平，并诱导了多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]的剪切，证实芹菜素通过Caspase依赖的途径促进细胞凋亡。Scherbakov等[8]研究发现在芹菜素存在的情况下培养HER2阳性乳腺癌SKBR3细胞可导致HER2/NEU基因表达下降，并伴有凋亡底物PARP的剪切。PARP是细胞凋亡核心成员Caspase的切割底物，在细胞凋亡中发挥着重要作用。Choi等[17]研究发现芹菜素通过线粒体/Caspase通路诱导人乳腺癌MDA-MB-453细胞凋亡。Chen等[18]研究发现芹菜素不仅可以抑制MDA-MB-231细胞的蛋白酶样活性，而且可以诱导MDA-MB-231异种移植细胞的凋亡。Kabała-Dzik等[19]也研究发现芹菜素在人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞中表现出细胞毒活性，并诱导细胞周期阻滞和凋亡。Peluso等[20]研究发现芹菜素通过抑制磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）/Akt和激活叉头框转录因子O3A（与ROS减少相关）诱导MCF-7和三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）细胞系的凋亡和细胞周期停滞。

自噬是真核细胞中高度保守的自我消化过程，广泛参与调节细胞生长发育、衰老死亡。自噬是细胞利用溶酶体降解受损细胞器和大分子物质的过程[21]。Cao等[22]研究发现芹菜素处理后的细胞表现为自噬，荧光显微镜下可见自噬体的出现，流式细胞术显示酸性泡状细胞器的积累。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤处理后，芹菜素诱导的凋亡显著增强，并伴有PARP切割水平的增加。作为有效的凋亡诱导剂，芹菜素对癌细胞具有细胞毒性。芹菜素可以通过Caspase激活、PARP切割和促凋亡和抗凋亡标记Bcl-2相关X蛋白/B细胞淋巴瘤2（Bax/Bcl-2）比率增加诱导凋亡[22]。在BT-474和MDA-MB-231异种移植小鼠模型中，芹菜素通过诱导细胞凋亡和抑制蛋白酶体活性和血管内皮生长因子来抑制生长[18，23]。有趣的是，在MDA-MB-231细胞中，芹菜素通过下调细胞人类细胞同源FLICE样抑制蛋白（cellular homolog FLICE-like inhibitoryprotein，c-FLIP）的表达和增强死亡受体5的表达，诱导肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）介导的凋亡[24]。芹菜素还通过与核内不均一核糖核蛋白A2（heterogeneous nuclear ribonucleoprotein，HnRNPA2）的直接相互作用，降低MDA-MB-231中c-FLIP和Caspase-9b剪接异构体的水平，这两种关键的RNA异构体在翻译时在抑制癌细胞凋亡中起作用[25]。

3 芹菜素抑制乳腺癌的侵袭和转移

恶性肿瘤细胞主要的特性在于它的侵袭性和转移性。肿瘤的侵袭和转移是多因素综合作用的结果。肿瘤侵袭、转移部分归因于肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的复杂性。巨噬细胞是TME中丰富的关键免疫细胞，能够调节肿瘤的生长、侵袭、转移和免疫抑制[26-27]。TME和循环髓系祖细胞中肿瘤相关巨噬细胞数量的增加，包括炎性单核细胞和髓系衍生抑制细胞，与肿瘤生长、侵袭、转移和免疫抑制相关[28-31]。这些细胞在肿瘤生长、转移、浸润过程中可分泌多种炎症因子，例如TNF、IL等。晚期乳腺肿瘤具有高浓度的TNF-α，贯穿肿瘤间质环境，促进C-C基序趋化因子配体的持续释放。这些强效趋化因子随后可以引导白细胞亚群大量进入肿瘤内，从而导致肿瘤免疫监视功能丧失，进而导致肿瘤快速生长。肿瘤内的浸润能使免疫逃逸、肿瘤生长、血管生成和转移。Perrott等[32]研究发现芹菜素通过抑制IL-1α、IL-1受体相关激酶1、IRAK4、p38-丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和NF-κB信号通路抑制CXC趋化因子配体10和干扰素诱导蛋白10的表达和分泌。这是一种新发现的分泌表型（senescenceassociated secretory phenotype，SASP）因子。通过抑制细胞增殖、细胞外基质侵袭和上皮间充质转化，芹菜素介导的SASP抑制显著降低了人乳腺癌细胞的侵袭表型。

Bauer等[33]研究发现芹菜素可下调TNBC致瘤性白细胞亚群浸润相关基因。芹菜素可以降低C-C基序趋化因子配体2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、IL-1α、IL-6和NF-κB激酶亚单位ε的活性。在TNF-α上调的75个基因中，芹菜素有效下调了35个基因。上皮细胞向间质转化是肿瘤转移的重要过程。Lee等[34]研究发现肿瘤微环境中IL-6与EMT呈正相关。芹菜素对MDA-MB-231来源的异种移植瘤的抗侵袭作用是通过抑制IL-6连接的下游信号通路介导的。

HnRNPA2是一种负责调节核糖核酸稳定性和基因表达的核糖核酸结合蛋白[35]。HnRNPA2可以通过直接调节与抵抗凋亡、炎症和转移有关的基因来参与增强细胞的肿瘤潜能[35-38]。芹菜素可抑制HnRNPA2二聚化，影响其剪接活性。此外，芹菜素还能直接结合黏蛋白1（mucin1，MUC1），一种参与肿瘤生长和转移的关键癌基因[39-40]。众所周知，MUC1通过改变细胞对谷氨酰胺的依赖性来调节MDA-MB-231细胞的代谢重编程，这归因于谷氨酰胺代谢的变化[41]。

有研究者对芹菜素抑制乳腺癌浸润与转移作用机制进行了深入的研究。Hong等[42]研究发现芹菜素抑制MDA-MB-231乳腺癌球状体的内扩散机制，从而阻碍其通过淋巴内皮屏障的生长和迁移。Lee等[43]研究发现芹菜素可抑制人类生长因子（human growth factor，HGF）促进的侵袭性生长和转移，通过阻断PI3K/Akt通路和β-4整合素在MDA-MB-231细胞中的功能。在TNBC中，Yes相关蛋白和转录共激活因子PDZ结合基（YAP/TAZ）的过表达与肿瘤干细胞的生物活性、高组织学分级和转移相关。Li等[44]研究发现芹菜素通过抑制YAP/TAZ蛋白活性来抑制TNBC细胞的干细胞样特性。

4 芹菜素抑制乳腺癌的血管生成

血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）也被称为血管通透性因子，它对血管内皮细胞具有高度特异性，具有促进血管通透性、促进内皮细胞的增殖等重要的生物学功能。VGEF在乳腺癌中高表达，对乳腺癌新生血管形成及肿瘤生长和转移起重要作用。金雪瑛等[13]研究发现芹菜素可抑制乳腺癌细胞VEGF的表达，其作用可能是通过降低缺氧诱导因子1α的表达来实现的。Mafuvadze等[45]研究发现在乳腺管癌T47-D细胞中，芹菜素（50或100 mmol/L）抑制了VEGF mRNA和蛋白的诱导，降低了孕激素受体水平。芹菜素也阻断了醋酸甲羟孕酮依赖性的BT-474细胞的VEGF分泌。

5 芹菜素通过免疫调节抑制乳腺癌

芹菜素在巨噬细胞及其髓系祖细胞中发挥免疫调节活性。芹菜素可降低NF-κB p65亚单位的磷酸化，这是其转录活性的原因。即使在炎症刺激后加入，芹菜素可降低巨噬细胞中TNF-α和IL-1β的表达，这表明其具有治疗潜力[46]。芹菜素还降低巨噬细胞中一氧化氮合酶和环氧合酶的表达[47-48]。研究还发现芹菜素通过增加ROS积累和高Caspase-3活性，随后激活MAPK途径，诱导小鼠巨噬细胞ANA-1细胞凋亡[49]。TME和循环髓系祖细胞中肿瘤相关巨噬细胞数量的增加是免疫监测缺陷的原因[28-30]。这些细胞的存在与肿瘤转移增加和临床预后不良相关[31]。黄酮类化合物对健康的益处历来被归因于其固有的化学结构导致的螯合和抗氧化特性[50]。多个羟基的存在以及高度共轭的离域电子系统增强了黄素的自由基清除性质，并与细胞的自由基清除活性相互作用[51]。黄酮类化合物（包括芹菜素）已被证明能阻断巨噬细胞中活性氧的产生，从而调节其免疫活性[46，52-53]。这些发现都表明芹菜素可以通过影响TME生态系统的组成部分来发挥免疫调节作用影响乳腺癌肿瘤生长及其转移。

6 芹菜素在乳腺癌治疗中具有增效、增敏、减毒作用

化疗耐药是癌症成功治疗的严重障碍。癌细胞对化疗药物产生适应性和耐药性，最终产生多药耐药细胞，导致肿瘤的侵袭性生长和转移。耐药是由多种因素引起的，包括P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）和多药耐药基因（multidrug resistance gene，MDR）的过表达。使用天然黄酮类化合物对化疗药物进行增敏已成为一种令人感兴趣的方法，旨在增强细胞毒性效应的功效，延迟获得性化疗耐药性的发生，并停止增殖途径[54-55]。几项使用细胞模型的研究提供了强有力的证据，表明芹菜素可以提高当前疗法的疗效。芹菜素可作为药物转运蛋白的竞争性抑制剂，包括乳腺癌受体蛋白、ABC转运蛋白、P-gp和多药耐药相关蛋白[56-58]。Seo等[59]研究发现芹菜素通过减弱信号传导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信号通路降低MCF 7-阿霉素耐药细胞系中多重耐药菌、线粒体核糖体蛋白和P-gp的表达。Liu等[60]研究表明芹菜素通过p53机制在MCF-7细胞中增强顺铂的细胞毒性。从机制上讲，芹菜素已被证明能增加治疗药物受体的表达。Horinaka等[61]研究发现芹菜素增加了死亡受体5的表达，从而通过抑制NF-κB途径和Caspase-3、-8、-9和-10的激活，在多种癌细胞系中促进了TRAIL诱导的和化疗诱导的细胞毒性。因此，芹菜素和TRAIL联合治疗可能是一种有前途的治疗乳腺癌的方法。Seo等[62]研究发现芹菜素通过阻断乳腺癌细胞中的STAT3信号来克服耐药性。

对阿霉素获得性耐药是TNBC治疗的主要障碍。Sudhakaran等[63]研究发现芹菜素通过靶向HnRNPA2使TNBC球状体对阿霉素诱导的凋亡敏感，并调节ABC转运蛋白家族4（ATP-binding cassette transporter family class C4，ABCC4）和三磷酸腺苷结合盒超家族成员2（ATP-binding-cassette superfamily G member 2，ABCG2）药物流出载体的表达。Korga-Plewko等[64]研究发现芹菜素在减少药物氧化损伤的同时，增强了阿霉素的细胞毒反应。

大约80%的乳腺癌病例表达雌激素受体，随着时间的推移，这些病例中有30%～40%对内分泌治疗产生耐药性[65]。Akt的超活化是获得内分泌抵抗的机制之一[66]。Pham等[67]研究发现MCF-7/Akt细胞的增殖部分独立于雌二醇，并对抗雌激素药物4-羟他莫西芬表现出不完全反应，这表明这些细胞对激素治疗具有耐药性。芹菜素可通过降低FOXM1这一参与细胞周期的关键转录因子的表达来抑制Akt/FOXM1信号通路。此外，Harrison等[68]研究也发现高浓度的芹菜素处理的MDA-MB-468细胞也显示了Akt磷酸化水平的降低。

7 小结和展望

近年来，黄酮类化合物抗肿瘤作用已成为国内外研究热点，其有效性正在被逐渐认可。黄酮类化合物是一种植物多酚类物质，在预防和治疗乳腺癌方面都具有广阔的应用前景。而芹菜素作为黄酮类化合物中的一种天然物质，因其低毒性及抗癌特性而广受关注。众多实验已证明芹菜素具有抗乳腺癌的作用。乳腺癌的病因及发病机制复杂，其发生是一个多因素诱导、多基因参与和多路径相互作用的复杂过程。

综上所述，芹菜素可通过调控细胞周期和抑癌基因表达、抗雌激素作用等方式来抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡和自噬，通过调控多种信号通路抑制乳腺癌侵袭、迁移和血管生成。此外，芹菜素还能通过有效增敏化疗药物以及抗内分泌耐药发挥协同抗乳腺癌作用。但芹菜素抗乳腺癌的关键靶基因及microRNAs调控等方面的研究尚不充分，需要进一步深入探讨；目前对于芹菜素的药理研究大多集中在体外癌细胞模型和临床前动物模型阶段，还需要进一步进行其成药性评估并加强临床前的药理和毒理试验，以期将其开发成抗乳腺癌新药或放化疗协同剂，造福乳腺癌患者。