鲤春病毒血症病毒检测方法研究进展

么宝兰，李月红

(吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春 130118)

鲤春病毒血症病毒(SVCV)会使鲤科鱼暴发鲤春病毒血症。该病传染性极强、死亡率极高，发现病鱼就要对其进行及时识别和扑杀(Ahne W 等，2002)。鲤春病毒血症被世界动物卫生组织(OIE)列为一旦发现则必须向有关部门申报的疾病，被我国列为二类动物疫病(孙翰昌等，2020)。2018 年国家市场监督管理总局发布的鲤春病毒血症诊断规程，规定了鲤春病毒血症的采样、病毒分离培养、RT-PCR、实时定量RT-PCR、酶联免疫吸附实验、间接免疫荧光抗体实验、综合判定的方法。本文主要是对SVCV 的检测方法和研究现状进行综述，以便为相关人员提供借鉴和参考。

一、反转录—聚合酶链式反应

反转录—聚合酶链式反应是将PCR技术进行加工，把RNA 的反转录(RT)和cDNA 的聚合酶链式扩增(PCR)这两种方法组合，形成的最基础的核酸检测技术，是最普遍RNA 病毒检测技术之一(Bachman J，2013)。高隆英等(2002)利用RT-PCR 和半嵌套PCR(semi-nested PCR)两种方法检测SVCV，当病毒在1 000 个以上时就可以检测出阳性结果。半嵌套PCR 与普通PCR 不同的是第二轮扩增的时候使用的引物有一条为第一轮PCR的引物，这样做大大地提高了检测的灵敏性。Koutna M 等(2003)采用RT-PCR和巢式PCR相结合的方法，巢式PCR进行了两轮PCR 扩增，提高了PCR 扩增的灵敏度和特异性。Shimahara Y等(2016)设计的引物可以扩增所有4 种SVCV 亚型，检测的最低浓度为7.1×102拷贝，能够快速识别有鲤春病毒血症临床症状的鱼。RT-PCR 之所以能够被广泛应用，是因为其操作简单，检测量也能达到理想的要求。

二、实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是在PCR的基础上发展起来的技术，是在“封闭管”系统中实时对目标DNA进行扩增和产物定量的技术(Bunce M 等，2012)。此方法避免了PCR 的后续操作，具备很多RT-PCR 没有的优点，比如减少样品污染、不需要凝胶电泳检测扩增产物等，被广泛应用于病毒的检测(Bustin S A 等，2005)。Yue Z等(2008)利用Taq-Man探针定量检测SVCV，能可靠地检测到40拷贝的病毒RNA。近年来对Taq-Man 探针进行改良发展出TaqMan-MGB 探针，能够极大地提高探针的TM 值，增加杂交反应的特异性，还可以用来分析基因突变，可以尝试将其应用到SVCV 的检测当中。安伟等(2015)建立了检测SVCV 的SYBR GreenI 荧光定量RT-PCR 方法。这种方法检测周期短，检测全程只需2～3 小时，而且检测期间全封闭，与其他鱼类病毒无交叉反应，特异性非常强，比传统PCR 灵敏100 倍。SYBR GreenI 荧光定量RT-PCR 作为第二代PCR 技术，相较于普通PCR，不仅特异性和灵敏度增强，而且还能进行核酸定量。Shao L(2016)等建立了一种精确检测SVCV 的N-靶向实时PCR 策略，通过RT-qPCR 检测，结果表明所有引物和探针均能特异、高效地检测系统发育上的SVCV 分离株。此方法为SVCV的快速诊断提供了可靠的工具。

三、环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术(LAMP)是一种恒温核酸扩增技术，它的突出优点是针对靶基因的6个区域设计4种特异性引物，利用链置换DNA聚合酶在恒温条件下扩增，操作起来非常简单，非常适合现场快速检测。此方法价格低廉，是当前临床诊断常用方法。Liu Z等(2010)基于SVCV的M基因进行RT-LAMP检测，并且对扩增条件进行优化。该方法具有较高的特异性，比巢式反转录—聚合酶链反应灵敏度高10 倍。Shivappa R B 等(2008)分别进行LAMP 和RT-LAMP 扩增，结果显示检测灵敏度与RT-PCR 相似。LAMP 对引物设计的要求比较高，倘若引物设计不好或者有污染，可能会出现假阳性的问题。LAMP 作为能够在现场进行实地检测的方法，在基层的检测中被广泛应用。

四、酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)是用于检测血清中存在的微量抗原或抗体的方法(Plested J S 等，2003)。ELISA是酶免疫测定技术中应用最广的技术，主要用于血清学调查、抗体效价评估以及多种疾病的诊断防控，常用的方法有双抗体夹心法、直接法和间接法(Lequin R M，2005)。ELISA 具有快速、敏感、简便、易于标准化等优点，可进行大规模临床检测且价格低廉(Hornbeck P，2015)。郭闯等(2012)建立了快速检测SVCV 的间接ELISA 方法，用得到的兔抗SVCV 免疫血清验证经过细胞培养和RT-PCR 方法鉴定过的鲤春病毒血症样品，结果显示符合率100%。此方法前期兔抗SVCV 抗体的制备需要耗费大量的时间和精力

五、重组酶聚合酶扩增技术

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification，RPA)是高度敏感和具选择性的核酸扩增技术，是近几年新发现的技术并且被广泛应用(Kojima K 等，2021)。因其检测设备小型化，能够实现现场诊断，适合基层实验室及就地检测(Lobato I M 等，2011)。田城城等(2020)建立了SVCV的RPA检测技术，结果显示RPA的检测方法比PCR 灵敏度高、稳定性好、特异性强，而且对其他水生动物疫病病原不发生特异性反应。梁君妮等(2019)建立了基于RPA 的SVCV 检测方法，该方法只需20 分钟即可完成全部反应，最重要的是能够有效检出RT-PCR 方法不能检出的弱阳性样品。Cong F 等(2020)使用实时RT-RPA 检测和实时RT-PCR 方法检测了65 份临床样本，观察到相同的检测结果。结果表明实时RT-RPA 检测可以有效地检测出SVCV，这种检测方法在实验室和现场诊断SVCV 方面都很实用。与LAMP 相比，引物的设计比较简单，而且RPA 技术主要依赖于3 种酶：能结合单链核酸的重组酶、单链DNA结合蛋白酶和链置换DNA 聚合酶，整个过程进行得非常快，能够快速地检测出SVCV，具有广阔的应用前景。

六、数字PCR

数字PCR(Digital PCR，dPCR)是高灵敏度、准确的绝对定量目标分子的技术，是在普通PCR、荧光PCR 方法之后出现的，属于第三代PCR 方法，可以将其大致分为微滴式数字PCR和3D数字PCR等(Kanagal-Shamanna R，2016)。数字PCR本质上是结合了传统PCR 的简单性和实时定量PCR 方法的定量特征(Pomari E等，2019)。数字PCR的原理是最大稀释的样本被划分为单分子水平，然后进行PCR扩增，最终通过统计分析阳性微滴或阳性反应孔数量，计算出模板中目标核酸的初始拷贝数量(Morler A，2014)。与产生指数信号的实时PCR不同，数字PCR 产生线性数字信号，允许定量分析PCR 产物，而且数字PCR 能够对核酸进行绝对定量，比qPCR 更快、更精准，被广泛应用于疫病潜伏期和早期诊断以及核酸标准物质研制。吴斌等(2015)建立了快速检测鲤春病毒血症的数字RTPCR 方法，通过对实时定量RT-PCR 和数字RT-PCR这两种方法进行比对，两种方法的灵敏度基本一致，但数字PCR能够检测数值，给鲤春病毒血症的早期快速诊断提供了重要的依据。数字PCR作为近年来流行的一种检测方法，其灵敏度和特异性都高于qPCR，而且它还具有对单个微滴中的目的基因进行检测的优点，但是此方法需要较为昂贵的仪器，较难推广使用。

七、其他

随着研究人员对SVCV 不断地深入研究和科学技术的不断进步，如今已经建立了一些较为成熟的检测技术，如液相芯片技术、焦磷酸测序技术和核酸探针等。Tong G 等(2017)开发了一项检测SVCV 的液相芯片技术，利用SVCV 中G 基因设计特异性引物，并且用生物素标记的同时进行胺化修饰，检测反应体系中的荧光信号。此检测系统对SVCV 具有很高的灵敏度，特异性强，不易交叉检测其他病毒。它的优点为检测周期短、检测样本量少、核酸和蛋白质都可检测、可高通量检测多种病原体(尹伟力等，2013)。刘瑶等(2017)建立了SVCV 焦磷酸测序检测方法，最低检出核酸量为10皮克/微升，而且只需要3～4小时就可以得到结果，可以有效地检出常规RT-PCR 不能检出的假阴性和弱阳性样本。这是一种新型的能够对病原体一段保守的已知短序列进行测序分析的方法，该方法是在普通PCR 基础上，对PCR 产物进行测序，不需要凝胶电泳，被广泛应用于病原微生物快速鉴定(尹伟力等，2017)。Oreshkova S F 等(1999)构建了DNA探针，并且进行生物素标记，利用SVCV中M和G基因设计特异性引物，使用非放射性探针和RT-PCR 对感染细胞培养物和鱼类致病物质中病毒RNA 检测的敏感性和特异性进行了研究。利用DNA探针和斑点杂交技术检测SVCV，结果显示在鱼的大脑中比较容易检测到这种病毒。此方法既实现了快速检测，又提高了灵敏度。

八、展望

SVCV 的检测方法研究起步较晚，大部分是参考动物和人类病原的检测方法，所以应用于其他病毒的检测方法也可能适用于SVCV 的检测。例如狂犬病毒同属于弹状病毒科，而且作为人畜共患病，对此病毒的研究更为广阔，也是近年来热门研究的重点，所以人们可以借鉴狂犬病毒的检测方法来设计检测SVCV 的试验。胶体金侧向流层析技术是近年来比较流行的快速检测技术，该方法不需要精密仪器，更适合于现场操作。原理是将样品与胶体金标记物混合，达到抗原与抗体结合的目的，在检测线上会显示颜色，从而来判定结果。根据此技术开发的检测试纸条已经被广泛应用，但是也会出现肉眼观察误差和假阳性的情况，所以通常将此方法与PCR、LAMP、RAP 技术相结合，不仅更适合于现场检测，还使结果更加具有说服力。检测方法的不断创新和完善给水产养殖业带来新的希望，高效率的检测方法将是未来研究的发展趋势，相信未来一定会发现快速、准确、价格低廉的检测方法，对SVCV 的防控起到非常积极的作用。