一种细胞固定和密度估算及塑形一体化装置设计

田野，刘肖（通信作者），于超，杨润，刘路录，张志勇

1 解放军总医院海南医院 （海南三亚 572013）；2 解放军联勤保障部队第九六〇医院（山东济南 250012）；3 解放军总医院海南医院 （海南三亚 572013）

人体器官上皮因自然更新所脱落的细胞，被称为脱落细胞。临床常见的含有脱落细胞的样本主要包括：尿液、痰液、乳汁、精液等自然排出液，胸水、腹水、心包积液、脑脊液、卵巢囊肿液等体腔抽出液，以及宫颈、口腔等体腔搔刮细胞。脱落细胞样本能够为多种疾病的诊断提供重要参考依据[1-2]，且具有取样简便、可多次重复、对患者损伤小、患者依从性高的优势。

涂片、推/拉片、滴片等是目前最常用的脱落细胞制片方法[3]，此类方法无需使用特殊的仪器设备，通常先将脱落细胞样本进行固定和离心浓缩，然后将浓缩液滴在载玻片上，再分别通过涂抹、推拉或自然沉降的方法，使细胞在载玻片表面形成薄层，风干后洗涤染色；此类方法靠肉眼预估细胞密度，制片往往出现细胞叠加堆积，导致镜下观察困难，易发生漏诊、误诊[3]。薄层液基制片技术（thin-cytologic test，TCT），制片效果好且可实现全自动化，目前多被应用于宫颈脱落细胞样本[4]；但是该方法制得的细胞制片较易脱片，无法耐受常规的高温抗原修复步骤，因此病理科在进行免疫细胞化学（immunocytochemistry，ICC）染色检测时，通常需要先制作细胞蜡块再行切片染色[5]，同时该方法需要采用特定仪器和耗材，除宫颈细胞外，其他类型样本由于处理步骤繁复且成本较高，临床应用较为受限。

制作细胞蜡块，通常要先对脱落细胞样本进行逐级离心浓缩，然后离心沉降，再将细胞团块从离心管中取出[6]，但该方法取出的细胞团块大小不一，易破碎丢失细胞。因此也有在细胞浓缩悬液中加入琼脂、血浆凝固酶等使细胞凝结为团块[7]，再进行石蜡包埋，但加入此类凝固剂后可能导致ICC 染色背景加深或出现污染。此外，上述方法均仅凭肉眼观察和以往工作经验评估细胞密度，缺乏客观性。由此可见，以上细胞制片方法均存在一定局限。

基于上述情况，如何进一步提高脱落细胞制片技术方法的标准化程度、效率，是技术工作者所面对的重要问题。为此，本研究旨在开发一种可快速进行脱落细胞样本固定、细胞密度估算和细胞团块制作的装置，并对以该装置制作的细胞蜡块石蜡切片的苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和ICC 染色效果进行观察和评估，从而明确该装置的临床应用价值，为开发新的脱落细胞样本制片技术提供实验依据。

1 设计

1.1 样本采集和保存

本研究样本为：经病理检测后剩余的胸、腹水各6 例，共计12 例样本以细胞保存液（安必平，粤穗械备20140065 号）固定，样本和保存液的体积比为5‥1。采用细胞计数板（Watson，177-112C）计数细胞悬液密度后，将样本置于50 ml 透明离心管中4 ℃保存，1 个月内完成所有检测。

1.2 细胞离心管的设计、制作和验证

本装置由细胞离心管和密度标签组成。其中，离心管包括管体和上、下管盖（图1 A）。管体外径为28 mm，总高为 125 mm，与常见的50 ml 离心管外尺寸基本一致，适用于市面上常见的50 ml 离心机转子，容积大于50 ml；下管口内径为4 mm，高度为10 mm；管壁厚度为2 mm，斜坡及下口处增加至3 mm，以确保其机械硬度。上、下口及管盖均为螺纹口设计；此外，在下管盖内还增加了厚度为1.5 mm的橡胶密封垫片，以进一步增强下口密封性。

目前，可用于三维立体（3 dimensions，3D）打印的材料很多[8]，其中丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（acrylonitrile butadiene styrene，ABS）是一种常用的热塑性树脂材料，具有强度高、韧性好、易于加工成型，具加工产品表面光洁，机械性能良好[9]。因此，我们使用了ABS 作为本装置离心管的3D 打印材料，并打印了成品模型（图1 B）。

图1 细胞离心管

由于3D 打印建模的设计尺寸与成品尺寸存在一定偏差，尤其是螺纹等精密部件[10]，因此，为进一步测试其刚性和密闭性，我们在3D 打印模型中加入50 ml 蒸馏水，拧紧管盖后，2 000 ×g，离心15 min，以管体、管盖无变形同时无漏液为符合性能要求的标准，否则修改建模设计参数，以补偿误差值，重新打印模型。

1.3 密度标签的设计、制作和验证

密度标签由两个不同灰度值的矩形和两条平行横线组成（图2）。左侧矩形三原色（red green blue，RGB）值为75、75、75；右侧矩形RGB 值为200、200、200；两个矩形大小均为7.5 mm×10 mm，横线长15 mm，间距为2 mm，RGB 值为0、0、0。

图2 密度标签

12 例已固定的胸/腹水样本各取4 ml，加至1 个50 ml 离心管中并充分混合，计数混合细胞密度并离心浓缩，再以0.9%氯化钠溶液将混合细胞配制为1×106、5×105、1×105、5×104、1×104个/ml 不同密度但体积均为15 ml 的细胞悬液，装入50 ml 透明离心管中；将密度标签贴附在离心管外壁，透过细胞悬液观察标签，并记录观察结果；随后将密度标签分别贴附在装有12 例胸/腹水样本的离心管外壁，根据上述观察结果评估各例样本密度，并与细胞计数结果进行比对。

1.4 细胞石蜡芯片制作及切片

12 例胸/腹水样本漩涡震荡15 s 混匀，各取40 ml 加入本装置离心管中，2 000 ×g 离心15 min，倾去上清液后，加入10 ml 95%乙醇，2 000 ×g 离心15 min，室温静置15 min，拧开上管盖倾去上清液。拧开下管盖，用3.5 mm 直径的玻璃搅拌棒从管内自下管口推出细胞团块，记录细胞团块直径和长度，放入包埋盒，以全自动脱水机（Sakura，VIP6 AI）进行常规脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋，制成细胞石蜡芯片。随后进行石蜡切片，切片厚度为4 μm，以防脱载玻片捞片，60 ℃烤至干片，4 ℃保存，1 个月内完成检测。

1.5 HE 染色、ICC 染色和结果评估

细胞芯片石蜡切片采用全自动染色封片机（Leica，CV5030）进行HE 染色，采用全自动免疫组化仪（Ventana，BenchMark ULTRA）进行广谱细胞角蛋白（pan cytokeratin，CK pan）（安必平，IM067）、细胞核相关抗原（nuclear-associated antigen ki-67，Ki-67）（Ventana，5278384001）ICC 染色。在光学显微镜下观察染色结果，并采集图像，分别对细胞形态和ICC 染色阳性信号的表达部位、强度、阳性细胞百分比、染色背景等进行评估。

2 应用效果

2.1 细胞离心管验证结果

以该细胞离心管3D 模型承装50 ml 蒸馏水，2 000 ×g 离心15 min，判定标准为管体无变形，管口无漏液。经验证，性能符合要求。

2.2 密度标签验证结果

透过离心管和不同浓度细胞悬液，观察密度标签（图3），记录标签2 个区域内的黑色横线是否可以被清晰分辨，结果如表1 所示。

图3 密度标签观察结果

采用密度标签，参照表1 所述标签观察结果，评估12 例胸/腹水样本细胞密度，并采用细胞计数板计数细胞密度，结果如表2 所示。

表1 密度标签观察结果

表2 脱落细胞样本信息

2.3 细胞团块和石蜡芯片

胸、腹水样本各取40 ml，以本研究设计的细胞离心管，制作为长度不一（表2）但直径均为4 mm 的圆柱形细胞团块（图4A）。其中有2 例样本（P1、A6）细胞数量过少无法直接采用本装置制作为细胞团块，取该2 例样本各120 ml，分3 管离心，随后将3 管沉渣混合至1 管中，以0.9%氯化钠溶液重悬为40 ml，再行离心制作细胞团块。随后将12 例胸/腹水样本圆柱形细胞团块按顺序排列，制作为细胞石蜡芯片，然后切片并进行染色（图4B）。

图4 细胞团块及细胞石蜡芯片

2.4 HE 染色和ICC 染色结果

细胞芯片石蜡切片HE 染色结果显示（图5A～B），细胞密度适中且无重叠，形态完整，核、膜、质结构清晰；ICC 染色结果显示（图5C～F），细胞形态完整，无脱片现象，CK pan 和Ki67 阳性信号清晰，定位准确。

图5 HE 染色和ICC 染色结果（200 ×）

3 讨论

液体中颗粒成分密度越高，浑浊度越高，透过液体观察某一物体的清晰度则越低[11]。根据这一原理，本研究设计了一种密度标签，将此标签贴附在装有细胞悬液的透明离心管外壁，透过细胞悬液观察标签，以标签2 个区域中的黑色双线是否清晰可见来评估细胞悬液密度。本研究对12例胸/腹水样本进行了评估，发现密度标签评估结果和细胞计数结果基本符合，该结果提示，较目测，采用此密度标签可更有效地区分密度高于或低于5×105个/ml 的体液样本。

本研究进一步采用特殊设计的细胞离心管，制作了细胞团块，结果显示，体液样本中的细胞数量与采用本装置制成的细胞团块体积并不成正比，推测是由于体液中所含细胞类型和比例差距较大导致。以体液样本体积为40 ml 计算，当细胞密度在5×105个/ml 以上，即可采用本装置一步获取直径为4 mm、长度在1 mm 以上可用于进行石蜡包埋的细胞团块；但当细胞密度不足5×105个/ml，则需要进行预浓缩，才能使用本装置制作细胞团块。本研究的12 例样本中，仅有2 例（胸水、腹水各1 例）需要进行预浓缩，因此本研究设计的离心管适用于绝大部分胸/腹水样本细胞团块的制作。

采用本装置处理脱落细胞样本，不但能够更准确地预估样本中的细胞数量是否满足制作蜡块所需，帮助技术人员确定所需样本体积；还可实现加样后一次直接成型，获得直径一致的圆柱形细胞团块，团块紧致不易松散丢失细胞，包埋切片后可形成直径基本相同的圆点，且无外源性物质，对HE染色和ICC 染色结果无影响。上述结果提示本装置临床应用效果较好。目前尚无类似装置在临床应用，因此本装置已申请国家实用新型专利并已受理（受理号202220169770.9）。

由于痰液、尿液、脑脊液等样本中细胞含量较少，本装置目前的设计并不适用上述检测，我们还将进一步研究低细胞含量样本的处理方法。

4 结论

本研究介绍了一种可用于脱落细胞样本固定、细胞密度估算和细胞团块制作的装置，该装置适用于细胞密度在5×105个/ml 以上的胸、腹水样本，能够提高检测效率，且有利于建立标准化的脱落细胞检测流程，具有较高的临床应用价值。