元蘑菌丝发酵多糖对小鼠免疫损伤的保护作用

冯卫红，姚 澜，吕建华，潘美晨，范冬雨，李长田

（吉林农业大学食药用菌教育部工程研究中心，吉林 长春 130118）

元蘑Sarcomyxa edulis（Y.C.Dai，Niem elä ＆ G.F.Qin）T.Saito，T.Tonouchi ＆ T.Harada 隶属于真菌界Fungi，担子菌门Basidiomycota，蘑菇纲Agaricomycetes，蘑菇目Agaricales，小菇科Mycenaceae，美味扇菇属Sarcomyxa［1-5］，又名亚侧耳［6-7］、冻蘑及黄蘑，在东北地区也叫冬蘑和美味冬菇，是东北的重要栽培菇，地位仅次于猴头菇和黑木耳，其形态似灵芝，颜色偏黄，也叫“黄灵菇”［8］。元蘑口感好，含有大量蛋白质、氨基酸、维生素和矿物质等营养元素［9-11］，此外其还具有预防动脉硬化、提高机体免疫力、抑制肿瘤增殖等作用［12-14］。酒中放元蘑后直接饮用，有一定药用价值［15］。元蘑生物活性高，国内外对其多糖在抗肿瘤、抗氧化、提高免疫力等方面作用比较关注［16-18］，对其药用价值也较为重视［19-20］。因此，本研究探讨了元蘑菌丝发酵多糖对环磷酰胺造成免疫损伤小鼠的保护作用。

1 材料

1.1 实验动物 SPF 级昆明小鼠，4 周龄，体质量18～22 g，由四平市铁西区爱普隆生物科技经销处提供。

1.2 仪器 H2100R 型高速冷冻离心机（苏州优格曼机械有限公司）；YW-SYS-20L 型生化培养箱（扬州市培英试验仪器有限公司）；352 型酶标仪（芬兰Labsystems 公司）；Milli-Q 型超纯水机（美国Millipore 公司）。

1.3 元蘑发酵液多糖 元蘑菌株SE1（编号HMJAU 2016092521），由吉林农业大食药用菌教育部工程研究中心提供。菌种活化发酵均采用cPDA 培养基，将长势好的液体菌种按10%左右的接种量接入cPDA 培养基，25 ℃、150 r／min 进行发酵培养12 d。将发酵到多糖含量较高时期的发酵液用旋转蒸发仪浓缩，温度60 ℃，多糖-乙醇比为1∶4，过滤后加入无水乙醇。将沉淀的多糖放入50 ℃烘箱进行烘干，得到粗多糖。

2 方法

2.1 造模及分组给药 60 只小鼠适应性饲养1 周，随机分为空白组、模型组、阳性组（0.02 mL／kg 黄芪精口服液）和元蘑多糖低、中、高剂量组（50、100、200 mg／kg），给药组灌胃给予相应剂量药物，空白组和模型组灌胃给予等体积生理盐水，第5 天灌胃结束后，连续3 d 腹腔注射80 mg／kg环磷酰胺以建立免疫抑制小鼠模型，空白组腹腔注射等体积生理盐水，并继续灌胃给药12 d。

2.2 ELISA 法检测血清细胞因子水平 灌胃结束后，小鼠称定体质量，眼球取血，3 000 r／min 离心10 min，分离得上层血清，按照ELISA 试剂盒说明书检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α 水平，用酶标仪于492 nm 波长处测定吸光度，根据标准曲线计算IL-6、IL-β、TNF-α 水平。

2.3 小鼠胸腺和脾脏指数计算 小鼠处死后用75%酒精消毒5 min，沿腹部正中线剖腹并取出胸腺和脾脏，去除筋膜组织，漂洗后吸干水分称重，以胸腺或脾脏质量和体质量的比值表示胸腺和脾脏指数。

2.4 小鼠脾脏淋巴细胞增殖检测 各组小鼠脾脏放入有200 目筛网的平板内，用1.5 mL RPMI-1640 培养基冲洗研磨，细胞悬液装入1.5 mL 离心管，1 500 r／min 离心5 min，红细胞裂解液重复裂解2 次，离心后用培养基洗涤，沉淀重悬于2 mL 含10%胎牛血清的培养基中，台盼蓝染色后调整各组细胞密度至1×106／mL，接种于96 孔板，每孔100 μL，再加100 μL ConA 溶液；另设对照孔，仅加200 μL 培养基，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养48 h，MTT 法检测OD570值，计算各组脾脏淋巴细胞增殖率。

2.5 粪便氨含量检测 参考文献［21-22］报道，用靛酚蓝比色法测定粪便氨含量。取约50 mg 结肠粪便样品，加NH4＋溶解液和蛋白沉淀液各500 μL，混匀，5 000 r／min 离心2 min，取200 μL 上清液加入含3.8 mL 超纯水的试管中，即样品溶液。96 孔板每孔加入200 μL 样品溶液，每组设3 个复孔，对照液（仅无粪便，其他添加溶液同样品液）调零，用酶标仪测定样品液吸光度值，根据粪便质量、稀释倍数等换算关系计算粪便样品中的氨含量，以μmol／g 粪便表示。

2.6 HE 和AB-PAS 染色观察小肠组织病理结构 取小鼠小肠组织，经固定、脱水、包埋、切片后，行常规HE 和AB-PAS 染色，观察小肠组织病理形态及杯状细胞数量［23-24］。

2.7 统计学分析 通过SPSS 26 软件进行处理，数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 元蘑菌丝发酵多糖对免疫抑制小鼠胸腺和脾脏指数的影响 胸腺调节免疫器官、免疫细胞［25］；脾脏产生免疫应答，合成活性物质［26］。表1 显示，与空白组比较，模型组小鼠胸腺和脾脏指数均降低（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，元蘑多糖低剂量组小鼠脾脏指数升高（P＜0.05）。

表1 各组小鼠胸腺、脾脏指数比较（±s， n＝10）

表1 各组小鼠胸腺、脾脏指数比较（±s， n＝10）

注：与空白组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 元蘑菌丝发酵多糖对免疫抑制小鼠细胞因子水平的影响 细胞因子一般可分为Th1、Th2、Th17、Treg4 种类型，Th2 型主要协助合成抗体［27］，IL-1β 可以诱发炎症反应及调节多种免疫功能［27-28］。表2 显示，与空白组比较，模型组小鼠血清IL-6 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，元蘑多糖高剂量组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01），中剂量组IL-6 水平升高（P＜0.01）。

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（±s， n＝10）

表2 各组小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6 水平比较（±s， n＝10）

注：与空白组比较，△△P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 元蘑菌丝发酵多糖对免疫抑制小鼠脾脏淋巴细胞增殖的影响 表3 显示，与模型组比较，元蘑多糖各剂量组和阳性组对ConA 诱导小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力有一定促进作用（P＜0.05），且呈剂量依赖性。

表3 各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖率比较（±s， n＝10）

表3 各组小鼠脾脏淋巴细胞增殖率比较（±s， n＝10）

注：与空白组比较，△P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05。

3.4 元蘑菌丝发酵多糖对免疫抑制小鼠粪便氨含量的影响 表4 显示，模型组小鼠粪便氨含量高于空白组（P＜0.05）；元蘑多糖高、中剂量组小鼠粪便氨含量低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 各组小鼠粪便氨含量比较（±s， n＝10）

表4 各组小鼠粪便氨含量比较（±s， n＝10）

注：与空白组比较，△P ＜0.05；与模型组比较，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.5 元蘑菌丝发酵多糖对免疫抑制小鼠小肠组织病理结构的影响 HE 染色结果如图1 所示，空白组小鼠小肠绒毛排列整齐，上皮细胞柱形，组织结构清晰；模型组小肠组织明显肿状，绒毛变短萎缩甚至断裂脱落；与模型组比较，元蘑多糖组小肠组织在形态结构上有一定的改善，绒毛长度及数量均高于模型组；另外，环磷酰胺及元蘑多糖对肠壁厚度均无明显影响。

图1 各组小肠组织HE 染色图

AB-PAS 染色结果如图2 所示，小肠组织结构形态与HE 染色结果大致相同，空白与阳性组小肠绒毛相对更完整，数量更多，排列整齐，组织结构也更清晰；与空白组比较，模型组杯状细胞数（蓝染）减少；与模型组比较，元蘑多糖组杯状细胞数增多。

图2 各组小肠组织AB-PAS 染色图

4 讨论

元蘑是珍贵的食药用菌，生物活性较高，其中具有生物活性化合物主要是多糖类，多糖的生物活性范围较广，是生命活动所需的基本物质，主要存在于元蘑子实体及菌丝体发酵液中。据报道，食用菌多糖能提高巨噬细胞的吞噬能力，具有调节免疫能力。除多糖类化合物外还有三萜类化合物、麦角甾醇、矿物质元素、黄酮类化合物等。食药用菌的三萜类化合物在自然界中大量存在，在纯天然物质中占比较大，可以用于保肝、镇痛、消炎、抑菌以及防治心脑血管疾病等［29］。食用菌对金属元素有富集的能力，吴英等［30］研究发现，食用菌中含有很多对人体有益的矿物质，且富集大量的锗和硒。食用菌黄酮类化合物具有神经保护、抗病毒、抗氧化以及抗癌等多种活性。缪钱江等［31］针对4 种食用菌进行实验研究，发现食用菌子实体中的总黄酮含量较髙，平菇黄酮含量最髙，且抗肿瘤活性最强，能够直接杀伤MCF7 细胞，秀珍菇抗氧化能力最强。

免疫抑制模型有3 种制备方式，一是使用免疫抑制剂致使免疫力低下，二是辐射诱导免疫低下，三是强电流刺激引起免疫低下［32］。本研究采用环磷酰胺注射诱导免疫低下模型，该模型稳定，免疫抑制效果明显，且不会危及小鼠生命。本文就元蘑多糖的药理活性进行了初步研究探讨，发现元蘑多糖可提高免疫抑制小鼠的细胞因子水平，尤其是对IL-6 的提高更为明显，可改善脾脏指数，促进脾脏淋巴细胞增殖，其中多糖高剂量组粪便氨含量低于模型组，对受损小鼠小肠组织形态结构具有改善作用。

综上所述，元蘑菌丝发酵多糖可提高环磷酰胺免疫损伤小鼠的免疫功能。