亲和超滤-液质联用技术在天然产物活性成分筛选中的研究进展

张文光，马智慧，孟文文，刘慧茹，赵东升，邓志鹏，刘江亭，赵 盼

（山东中医药大学药学院，山东 济南 250300）

天然产物是自然界生物历经几千年进化保留下来的初级或次级代谢产物，研究表明1981 年至2019 年全球上市的药物有64.9%来自于天然产物［1］。从天然产物中筛选得到的活性物质结构新颖、疗效好、不良反应少，鉴于其多样的生物活性和化学结构，既可以直接开发为新药，也可以作为先导化合物进行结构修饰与优化后成为新药［2］。目前对天然产物进行化学分离、结构鉴定、有效活性成分筛选的方法主要有活性追踪分离法［3］、柱后生物测定法［4］、前沿亲和色谱法［5］等，但存在时间长、劳动强度大、专属性差、微量活性组分不易检测、活性成分易丢失等问题，严重阻碍了探寻天然产物中活性成分的步伐。因此，如何从天然产物中快速高效地筛选活性成分，是研究重点。

现代药理学研究表明，药物与生物大分子的亲和性是其发挥作用的第一步［6］，因此，基于与疾病相关的生物大分子作为靶标进行药物筛选的分子靶向法应运而生。亲和超滤-液质联用（AUF-LC-MS）技术是基于溶液的亲和性选择平台，采用超滤方法分离溶液中的目标配体复合物，是从复杂天然产物中鉴定活性分子的有力工具。1997 年van Breemen 等［7］使用血清白蛋白和腺苷脱氨酶作为生物分子靶标，首次把液相色谱和电喷雾质谱技术联用筛选天然产物中的活性成分。亲和超滤技术应用于天然产物活性成分筛选，不但克服了传统筛选方法的缺点，可使天然活性成分的筛选与结构鉴定一步完成，而且能够有效避免微量活性物质的漏筛和杂质干扰，可提高筛选结果的准确率，现已广泛用于中药活性成分研究［8］。

1 流程、原理、应用优势

AUF-LC-MS 技术已成为受体-配体相互作用研究的通用方法，并在挖掘天然产物活性成分中发挥着越来越重要的作用。其流程为将选定的生物大分子（受体）与待筛选物质（靶标配体）在某一缓冲溶液中进行孵育；然后转移至合适孔径的超滤管进行离心超滤，未与生物大分子结合的物质将被离心至超滤管下层；其次用缓冲溶液洗涤未结合的配体小分子；最后将含受体-配体复合物的超滤系统转移至新的超滤管中，使蛋白变性，解离蛋白，收集下层含有与受体结合的靶标配体成分，随后用液质联用技术进行靶标配体的检测，从而实现天然产物活性成分的快速筛选［9］。其原理流程见图1。

图1 AUF-LC-MS 技术筛选天然产物活性成分流程图

AUF-LC-MS 技术基本原理是基于受体与靶标配体的结合亲和力，亲和超滤主要分为离心超滤（CU-LC-MS）和脉冲超滤（PU-LC-MS）。目前，离心超滤主要由商品化的超滤离心管实现，由于超滤膜的超低结合和各向异性，整个筛选过程可以通过多次离心洗脱快速完成。脉冲超滤由流动室、磁力搅拌器和超滤膜组成，将测试样品和目标蛋白加入流动室后，可以通过施加一定的压力来分离配体-受体复合物和非活性成分，与传统的筛选方法相比，具有自动化程度高、可反复使用受体的优点。虽然这2 种技术都可以用于亲和选择和配体富集，但它们的应用因设备本身相差较大。例如，离心超滤通常用于筛选活性小分子，而脉冲超滤在描述受体-靶标配体结合特征、药物代谢、产物测定方面更有效。

AUF-LC-MS 技术是前期处理受体和靶标配体，后期进入在线检测，利用液质联用技术进行分析，实验组的峰强度和峰面积大于对照组，表明化合物特异性结合到目标分子上，这就将高效液相良好的分离能力和质谱的分析能力结合起来。相比于其他筛选检测方法，具有以下优点，①不需要标记或固定目标或小分子；②以溶液为基础，并适合于适当的蛋白质折叠和稳定性所必需的不同缓冲液；③选择性地从复杂混合物中鉴定配体，提供多重筛选平台；④只需要适量的蛋白质产品。

2 影响因素

2.1 受体与靶标配体浓度 受体与靶标配体浓度是孵育过程中的2 个关键因素，为了获得良好的结合结果，首先对其进行方法学考察。引入了平衡解离常数KD值，受体与靶标配体的KD值应当相差不大，如果相差较大，容易造成假阳性、假阴性结果。受体浓度远大于配体浓度，易引起非特异性依附，造成假阳性结果；配体浓度远大于受体浓度，配体中的某些活性成分难以融入蛋白，造成假阴性结果。

2.2 超滤膜 超滤膜的选择主要涉及2 个方面，①孔径，对于超滤膜的要求应当是可以截留相应的生物大分子，同时又不会造成漏筛，通常来说孔径应当小于生物大分子的三分之一；②材料，最为理想的是对于潜在配体和受体没有特异性吸附作用，最常用的为纤维素类和聚醚砜类。

2.3 缓冲溶液 缓冲溶液贯穿实验前期准备阶段，其pH值对生物大分子影响很大，容易造成生物大分子的变性。理想状态是可以模拟人体环境，应当选择与人体pH 值相近的缓冲溶液，在使用过程中也应当注意缓冲溶液的污染问题。

2.4 解离液 能否在整个受体-靶标配体体系中解离出特定的活性成分对实验结果至关重要，解离液的选择是关键因素，一般选择有机溶剂作为解离液，例如纯甲醇使蛋白变性，将配体与受体解离开。

2.5 其他 除上面几项关键因素，孵育过程中离心管是否无酶、孵育温度、时间、离心速度、时间等影响因素均为干扰因素，需要进行方法学考察，以确保实验结果的准确。

3 应用

最近药理学研究表明，大多数药物通过与疾病相关的药物靶点（如酶和受体）相互作用发挥作用［10］。天然产物通常以其复杂的化学成分和多样化的生物功能为特征。因此，发现生物活性成分并进一步阐明其可能的作用机制是研究天然产物的2 个关键环节。AUF-LC-MS 结合了靶向生物分子的亲和超滤和液相色谱质谱强大的分离分析能力，可以实现高通量筛选和快速鉴定复杂天然产物中的生物活性成分。在亲和超滤过程中，将配体-受体复合物从未结合的化合物中分离出来，随后通过质谱分析进行定性。在这方面，质谱法不仅可以为新药发现提供新的思路和方法，而且有助于揭示生物活性成分的作用机制，由其液质检测灵敏度高、分子量范围跨度大，在复杂、微量、未知的天然产物得到灵活应用，扩大了亲和超滤筛选的范围。此技术在小分子药物发现、中药成分分析、活性成分追踪等方面均有较好应用，尤其是对于中药复方制剂来说，发挥作用的可能不是单一成分，而是多种成分产生协同作用的结果，应用AUF-LC-MS 技术便可快速的定位具体中药、定位具体成分，是研究中药药效物质基础的有效途径。

3.1 天然产物的高通量筛选 该技术可用于筛选包括α-葡萄糖苷酶［11］、黄嘌呤氧化酶（XOD）［12］、乳酸脱氢酶［13］、酪氨酸酶［14］等的潜在配体。Li 等［13］采用超滤高效液相色谱-光电二极管阵列检测-电喷雾电离质谱联用技术对射干提取物中的异黄酮进行筛选，鉴定射干中的鸢尾苷、鸢尾苷A、鸢尾苷等为乳酸脱氢酶抑制剂。Ning 等［15］运用亲和超滤结合超高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱技术从青钱柳叶提取物中鉴定出特定的α-葡萄糖苷酶抑制剂，并从青钱柳叶提取物中鉴定出11 种潜在的α-葡萄糖苷酶抑制剂，体外α-葡萄糖苷酶抑制实验证实，槲皮素、山柰酚等提取物是α-葡萄糖苷酶抑制活性的主要成分。Liu 等［16］采用AUF-LC-MS 法对丹参提取物中潜在的XOD 抑制剂进行筛选和鉴定，从提取物中鉴定出11 种亲脂性二萜奎宁为XOD抑制剂。Xie 等［17］成功建立了基于5-LOX／COX-2 酶亲和力的生物活性化合物鉴定和筛选的AUF-LC-MS 方法，从知母提取物中获得5 个生物活性化合物，为后续多靶点药物筛选提供参考。详见表1。

表1 亲和超滤技术筛选天然产物活性成分表

续表1

续表1

3.2 中药复方制剂中潜在活性成分筛选 Zhang 等［78］以α-葡萄糖苷酶为例，建立超滤液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速鉴定参芪降糖颗粒中生物活性成分的方法，从筛选单一天然产物中的活性成分推及到中药复方制剂，筛选出的α-葡萄糖苷酶抑制剂候选药物为开发和设计高效抗糖尿病药物的应用提供参考。详见表2。

表2 亲和超滤技术筛选复方制剂活性成分表

3.3 天然产物代谢途径分析和评价药物的代谢稳定性 对通过AUF-LC-MS 技术筛选得到的活性成分进行体外代谢研究，从而推断出可能的代谢途径。Huang 等［87］采用AUFLC-MS 技术对防风中LOX 抑制剂进行筛选，成功鉴定得到升麻素苷、5-O-甲维阿斯米醇、亥茅酚苷和亥茅酚，利用其有效成分对CYP450 的代谢进行研究，获得3 种染色质可能的代谢途径。AUF-LC-MS 联合其他技术不仅可筛选天然产物中LOX 抑制剂，还可以推断可能的代谢途径。Young等［88］运用脉冲超滤技术将细胞素P450 酶和8 种β 阻断药物进行混合分析，可以通过与孵育过程中其他化合物的比较来评估每个化合物的相对代谢稳定性。这种方法可能适用于根据代谢稳定性对药物先导物的定向库进行排序，为进一步天然产物的开发选择先导化合物。

AUF-LC-MS 技术具有可提供药物靶标和化合物之间的高通量结合信息的优点，适用于组成复杂的天然产物提取物，还能与分子对接、网络药理学等新兴技术联合应用，进一步验证配体-受体结合位点。鉴定有效的酶抑制剂／激动剂作为候选药物已经成为医学和生物学研究的重要目标之一［4］。总结来看，未来的研究方向为①某种酶发挥抑制作用研究较多，发挥激动作用的研究不足百分之一；②国内外对某一个天然产物研究的较多，大多集中在中药方面，对复方制剂、代谢产物的研究较少，还处在起步阶段；③由于天然产物成分的复杂性，某单一的活性成分是否可以和多个靶标相互作用还有待研究；④就某一个天然产物单靶标研究的较多，对于多靶标的探索还有待增加。

4 结语与展望

天然产物中有效成分的快速筛选是新药研发的重要一环，筛选的方法有亲和超滤-液质联用技术、磁性微球垂钓法、细胞膜亲和色谱法、固定化酶法、在线生物测定法［4］等。AUF-LC-MS 技术相对于其他筛选方法来说具有筛选速度快、结果准确性高、有效避免微量活性物质的漏筛和杂质干扰等优点，然而也有非常突出的局限性，比如小分子与靶标的非功能位点结合或超滤膜的非特异性结合导致假阳性结果等。解决方法是将正常酶变性作为对照，进入液质进行检测，比较化合物与正常和变性酶的峰面积，以排除假阳性结果。同时，酶活性实验和分子对接技术排除了许多潜在的非特异性结合化合物，有效地提高了亲和超滤-液质联用技术筛选的准确性和效率。

从目前来看，AUF-LC-MS 技术虽然可以快速地筛选出特定的化合物，但仍面临许多挑战，例如亲和超滤-液质联用从天然产物中筛选活性成分方面仍然主要针对1 个或2个靶标，关于多靶标筛选的报道很少，而发现多靶标抑制剂／激动剂更能满足现代医学的要求。同时，高通量液质联用筛选多种蛋白质靶标的技术也有望在不久的将来实现。

综上所述，无论是为了药物的发现还是为了更好地理解一系列人类疾病的发病机制，探索更多未知疾病相关蛋白质靶点，都对AUF-LC-MS 技术提出了更高的要求，相信该技术将在进一步研究天然产物中活性成分的筛选发挥更重要的作用。