丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成、热裂解及其在卷烟中的应用

梁德民，张 玮，王嘉乐，费 婷，李德国，奚 安，顾文博，吴 达

上海烟草集团有限责任公司技术中心，上海市浦东新区秀浦路3733 号 201315

糖苷类物质是许多天然香料的前体物，存在于自然界各种植物中，其本身无气味或气味很弱，常温下性质稳定，但经过热解、酶解或水解等条件，断裂糖苷键并释放出香味成分［1-2］。基于上述特性，糖苷类香料在卷烟加香领域有较好的应用前景。段海波等［3］合成了天然等同结构的玫瑰醇糖苷并添加至卷烟中，可以改善和修饰卷烟烟气、减轻刺激性，且克服了玫瑰醇因挥发而导致的释香不稳定问题。郭亚勤等［4］研究了红景天糖苷的热裂解成分并应用于卷烟中，发现红景天糖苷具有丰富卷烟烟气，提升烟气细腻柔和度，降低杂气的作用。曾世通等［5］研究合成了β-紫罗兰醇糖苷，在主流烟气中能裂解生成多种香味成分，且具有良好的释放稳定性和均匀性。李有桂等［6］报道了甲基环戊烯醇酮-β-D-吡喃葡糖苷的合成方法并进行热裂解实验，可为新型焦甜香烟用香原料的研发提供参考。

丁香酚（Eugenol），化学名称为4-烯丙基-2-甲氧基苯酚（FEMA 2467），是一种重要的天然芳香酚类香原料，具有典型的强烈丁香和辛香特征，在食品、医药及卷烟调香领域广泛应用［7］。丁香酚作为一种重要的烟用香原料，不仅能赋予卷烟辛香吃味，使卷烟的香气质、香气量有所增加，烟气中凸显细腻、圆润及柔和特征，还能够降低卷烟烟气的刺激性，对卷烟烟气有积极正面的作用，但常温下丁香酚在空气中易氧化，且嗅香重、挥发性强，对加香稳定性存在一定影响［8-9］。丁香酚-β-D-葡萄糖苷（以下简称丁香酚糖苷）是丁香酚的香味前体物，常温下稳定且不挥发，可明显改善丁香酚在卷烟加香中存在的问题，具有较好的应用前景［10-11］。因此，本研究中以实验室合成的丁香酚糖苷为研究对象，通过热失重及热裂解-气相色谱-质谱法对丁香酚糖苷进行热裂解规律研究，结合卷烟主流烟气分析考察丁香酚的烟气释放及糖苷加香应用效果，旨在为丁香酚糖苷类香料前体物在卷烟加香中的应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

空白未加香卷烟样品（上海烟草集团有限责任公司提供）。

丁香酚（＞98%）、安伯莱特IR 120（H）离子交换树脂（北京百灵威科技有限公司）；氢氧化锂、甲醇钠、正十七烷、葡萄糖及其他试剂（AR，国药集团化学试剂有限公司）；丁香酚-β-D-葡萄糖苷（自制，产物结构经IR、NMR、HRMS表征，纯度＞98%）。

TGA8000热失重仪器（美国PerkinElmer公司）；5250 热裂解仪（美国CDS 公司）；7890A/5975C 气相色谱-质谱联用仪（美国Agilent 公司）；RM20H 转盘式吸烟机（德国Borgwaldt公司）；AV500核磁共振仪（500 MHz，德国Bruker 公司）；RE-52 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；CIJECTOR 香精香料注射仪（德国Burghart 公司）；XS105DU 电子天平（感量0.000 1 g，瑞士Mettler 公司）；KBF240 恒温恒湿箱（德国Binder公司）。

1.2 方法

1.2.1 糖苷的合成

丁香酚糖苷的合成路线如图1 所示，中间体和产物的结构以NMR 进行表征，产物4 为目标化合物。

图1 丁香酚-β-D-葡萄糖苷的合成路线Fig.1 The synthetic route for eugenol-β-D-glucoside

1.2.1.1 溴代四乙酰葡萄糖（1）的合成

参考文献［12］的方法合成溴代四乙酰葡萄糖（1），得到淡黄色的固体，熔点为87～89 ℃，与文献报道值［13-14］符合，产品需低温保存。

1.2.1.2 丁香酚-2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-葡萄糖苷（3）的合成

取5.08 g（12.1 mmol）2,3,4,6-四-O-乙酰基-D-葡萄糖溴化物，溶于30 mL丙酮中；另取丁香酚6.01 g（36.5 mmol），溶于氢氧化锂的水溶液（1 mol/L，15 mL）中。将上述体系混合，室温下剧烈搅拌3 h，通过薄层色谱法监测反应进程。反应完成后，减压将反应体系中的丙酮除去，剩下的混合物用二氯甲烷（15 mL×3）萃取，合并的有机相再用10%氢氧化钠溶液（15 mL×3）洗涤，洗涤后的有机相用无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，得到粗产物。硅胶柱色谱法纯化粗产物，洗脱剂：V石油醚∶V乙酸乙酯=5∶1，得到2.25 g 目标化合物（3），为黄色油状液体，产率为37%。1H NMR（500 MHz，CDCl3），δ：7.07（1H，s），6.74（1H，s），6.70（1H，s），5.95（1H，s），5.29（2H，d，J=7.9 Hz），5.19（1H，s），5.11（2H，d，J=17.6 Hz），4.93（1H，s），4.29（1H，s），4.19（1H，s），3.82（3H，s），3.80（1H，s），3.36（2H，s），2.07（12H，d，J=22.5 Hz）。13C NMR（125 MHz，CDCl3），δ：170.6，170.2，169.4，169.2，150.5，143.8，137.5，136.5，121.5，120.5，115.8，113.4，101.1，77.2，76.8，72.5，72.1，61.5，57.2，39.8，20.6，20.6，20.5，20.5；ESI-MS（m/z）：517.1［M+Na］+。

1.2.1.3 丁香酚葡萄糖苷（4）的合成

将2.25 g（4.55 mmol）产物3溶解在V二氯甲烷∶V甲醇=1 ∶4 的10 mL 混合溶液中，加入甲醇钠245.9 mg（4.55 mmol），室温搅拌1 h，通过薄层色谱法监测反应进程。反应完成后，搅拌下加入安伯莱特IR 120（H）离子交换树脂直至体系pH=6～7，体系经过垫有硅藻土的漏斗过滤，滤液经减压浓缩，得到粗产物。硅胶柱色谱法纯化粗产物，洗脱剂：V石油醚∶V乙酸乙酯=1∶2 至纯乙酸乙酯，进行梯度洗脱，得到目标化合物（4）1.45 g，为白色固体，产率为97%，熔点为131～132 ℃。1H NMR（500 MHz，DMSO-d6），δ：7.00（1H，d，J=8.2 Hz），6.80（1H，s），6.67（1H，d，J=8.2 Hz），5.95（1H，td，J=16.9 Hz，6.8 Hz），5.19（1H，s），5.09（1H，s），5.04（2H，d，J=17.0 Hz），5.00（1H，d，J=5.1 Hz），4.84（1H，d，J=7.0 Hz），4.51（1H，s），3.74（3H，s），3.66（1H，d，J=11.9 Hz），3.44（1H，dd，J=11.6 Hz，5.8 Hz），3.30（2H，d，J=6.7 Hz），3.24（2H，s），3.14（2H，s）；13C NMR（125 MHz，DMSO-d6），δ：148.9，144.9，138.1，133.5，120.4，117.0，115.6，113.1，100.3，77.1，76.9，73.3，69.8，60.8，55.7，39.2；ESI-MS（m/z）：349.1［M+Na］+。

1.2.2 热裂解研究

1.2.2.1 丁香酚糖苷的热失重分析

分别称取2 mg 丁香酚糖苷和丁香酚至不同的100 μL 氧化铝盘中。以高纯氮气为载气，流速为20 mL/min，以升温速率为20 ℃min 从50 ℃升温至600 ℃，记录质量变化曲线。

1.2.2.2 丁香酚糖苷的热裂解分析

称取1 mg 左右的丁香酚糖苷固体，置于填充有玻璃毛的小石英管中，另一头用玻璃毛封上，将该石英管放入热裂解仪的加热丝中进行有氧裂解，裂解产物可通过GC-MS进行分析。

（1）热裂解条件：

A.不同温度条件下的裂解：裂解探头起始温度50 ℃，升温速率20 ℃/ms，分别升温至200、300、600、900 ℃后，分别保持30 s。

B.模拟卷烟燃烧裂解：按照Baker 裂解实验方法［15-16］，300 ℃保持5 s；30 ℃/s 升温至900 ℃，保持5 s。

冷阱的捕集温度为-60 ℃，冷阱进样条件为-60 ℃升至280 ℃，保持5 min。

（2）GC-MS 色谱条件：HP-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；进样口温度：250 ℃；载气He；载气流量：1.0 mL/min；分流比：100∶1；升温程序：40 ℃（3 min）离子源：EI 源；电离能量：70 eV；传输线温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：40～450 amu。

（3）裂解产物定性和分析：应用NIST 和WILEY质谱库进行检索定性热裂解产物，采用峰面积归一化法计算产物的质量分数。

1.2.3 加香应用研究

1.2.3.1 卷烟加香样品制备

称取0.2 g 丁香酚糖苷固体，溶解于10 mL 无水乙醇，配制浓度为20.0 g/L的溶液。

（1）烟丝加香：用香精香料注射仪将丁香酚糖苷溶液注射至空白卷烟中，每支卷烟加香量为10 μL，起始加香点为距烟丝与滤嘴连结处2 mm，终止加香点为距烟丝与滤嘴连结处58 mm。

（2）卷烟纸加香：使用香精香料注射仪将10 μL糖苷溶液均匀涂布在卷烟纸上。

分别取等量的丁香酚和无水乙醇采用相同方式加香制备对照卷烟和空白卷烟。

1.2.3.2 主流烟气释放分析

（1）主流烟气粒相物分析：取平衡过的加香烟支，用转盘式吸烟机按照标准条件抽吸卷烟。用剑桥滤片捕集烟气，每张滤片捕集20支卷烟的烟气粒相物。抽吸毕，将捕集粒相物的剑桥滤片折叠，放入250 mL 锥形瓶中，加入20 mL 甲基叔丁基醚溶液及200 μL 5.0 mg/mL 正十七烷内标溶液，室温下振荡萃取30 min，静置5 min。直接取样进行GC-MS分析。

（2）不同糖苷添加量分析：按不同加香量将丁香酚糖苷添加至卷烟烟丝中，同本节（1）中的操作方法，进行GC-MS分析。

（3）逐口分析：将烟丝加香的卷烟样品于转盘式吸烟机上分别收集卷烟的第2～第5口的逐口烟气粒相物，同本节（1）的方法处理剑桥滤片后，进行GC-MS分析。

（4）GC-MS条件：

色谱柱：DB-FATWAX UI 毛细管柱（30 m×250 μm×0.25 μm）；进样口温度：270 ℃；载气：He；载气流量：1.0 mL/min；分流模式：不分流；程序升温：离子源：EI源；电离能量：70 eV；传输线温度：250 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；质量扫描范围：35～450 amu。

（5）主流烟气化合物定性和分析：应用NIST 和WILEY质谱库检索并定性主流烟气化合物，采用内标半定量法计算产物的质量分数。

2 结果与分析

2.1 热失重分析结果

丁香酚和丁香酚糖苷的热失重DTG曲线如图2所示。丁香酚的DTG曲线只有一个吸收峰，丁香酚质量开始损失的温度约为50 ℃，其质量最大损失的温度约为149.5 ℃。丁香酚糖苷的DTG曲线有两个峰：第一个峰（小于100 ℃）可能是丁香酚糖苷中的水分、低沸点溶剂挥发而导致，而第二个峰是由于丁香酚糖苷分解而导致，质量损失的起始温度约为220 ℃，质量损失的最终温度约为370 ℃，其质量最大损失的温度约为290.5 ℃。丁香酚糖苷的热解温度相比丁香酚提高近170 ℃，因此，与丁香酚相比，丁香酚糖苷的热稳定性明显提高，有利于其在卷烟中的应用。

图2 丁香酚和丁香酚糖苷的DTG曲线Fig.2 DTG curves of eugenol and eugenol glycoside

2.2 丁香酚糖苷热裂解分析结果

不同温度条件下丁香酚糖苷的裂解结果如图3所示。300 ℃条件下，发现有裂解产物丁香酚产生，而200 ℃未发生裂解，这与热失重的结论一致。如表1所示，丁香酚糖苷裂解的主要产物为丁香酚，其他产物主要有糠醛、苯酚和2-甲氧基苯酚等。模拟卷烟燃烧的热裂解条件下，丁香酚糖苷裂解主要产物为丁香酚，占主要裂解产物的94%以上；裂解产物种类也未增加。

表1 不同温度条件下的热裂解产物峰面积Tab.1 Peak areas of pyrolysis products at different temperatures

图3 由80 ℃分别升至200和300 ℃时丁香酚糖苷热裂解的总离子流图Fig.3 TIC chromatograms of eugenol glycoside under pyrolysis from 80 ℃to 200 ℃and 300 ℃respectively

2.3 加香卷烟的主流烟气分析结果

2.3.1 主流烟气中丁香酚的释放量

考察丁香酚糖苷裂解产物在卷烟主流烟气中的释放情况。将空白、烟丝添加糖苷及卷烟纸添加糖苷、烟丝添加丁香酚的卷烟样品在标准条件下抽吸，采用GC-MS法分析其主流烟气粒相物成分。表2为主流烟气中主要代表性成分的化合物释放情况，结果表明：①与空白卷烟相比，添加丁香酚糖苷的卷烟主流烟气中产生丁香酚，焦糖化产物有些许增加，其他组分变化不明显。表明丁香酚糖苷在卷烟燃吸的过程中除糖苷键断裂生成丁香酚外，无其他明显副反应发生；此外，添加丁香酚的卷烟主流烟气中也产生丁香酚。②对比糖苷在卷烟中的两种加香方式可知，烟丝加香卷烟主流烟气中丁香酚释放量明显高于卷烟纸加香。这表明烟丝加香条件下，裂解生成的丁香酚更易进入主流烟气中，而卷烟纸加香裂解生成的丁香酚可能更易进入到侧流烟气中。以不同加香方式在卷烟中添加糖苷，可达到不同的加香效果。

表2 卷烟样品主流烟气中主要代表性成分的释放量①Tab.2 Releases of representative components in mainstream smoke of cigarette samples

2.3.2 糖苷添加量对主流烟气丁香酚释放量的影响由图4可以看出，卷烟烟气中丁香酚的释放量随着糖苷添加量的增加而增大，在所设加香浓度的梯度下，丁香酚的释放量与糖苷添加量基本上呈线性关系。

图4 主流烟气中丁香酚释放量与糖苷或丁香酚加香量的关系Fig.4 Relationships of eugenol releases in mainstream smoke with glycoside or eugenol addition rate

2.3.3 主流烟气丁香酚逐口释放量分析

烟丝加香卷烟样品的烟气丁香酚逐口释放量分析结果如图5所示。添加丁香酚糖苷的卷烟主流烟气中丁香酚逐口释放量基本一致，逐口稳定性较好；而添加丁香酚的卷烟烟气中丁香酚的逐口释放量呈现前高后低的变化趋势。这表明添加丁香酚糖苷的卷烟烟气中丁香酚的释放更为均匀。

图5 不同抽吸口数对应的主流烟气中丁香酚的逐口释放量Fig.5 Puff-by-puff releases of eugenol in mainstream cigarette smoke

2.4 丁香酚糖苷在卷烟中的应用

将空白卷烟与添加丁香酚、丁香酚糖苷的加香卷烟进行对比分析。添加了丁香酚、丁香酚糖苷的卷烟相比空白卷烟，烟气中均产生丁香酚，丁香酚的释放量均随添加量的增加呈线性增长，且丁香酚糖苷的添加效果优于丁香酚，主要表现为卷烟燃吸时释香均匀，前后一致。此外，由于丁香酚糖苷常温下十分稳定，耐高温、不挥发且气味弱，解决了丁香酚常温下易挥发、嗅香重，及加香不稳定等问题。

3 结论

①丁香酚糖苷的裂解温度在220 ℃以上，相比丁香酚具有更好的热稳定性。②丁香酚糖苷主要的裂解产物为丁香酚，副产物较少。③添加丁香酚糖苷的卷烟在主流烟气中释放丁香酚，释放量随糖苷添加量的增加而增加，且糖苷的不同添加方式可达到不同的加香效果。④丁香酚糖苷在卷烟应用中具有良好的加香稳定性，卷烟的释香更为均匀，加香效果不仅优于丁香酚，还可解决丁香酚存在的加香不稳定等问题，因此，可作为一种稳定的烟用香料前体，在卷烟加香中有较好的应用前景。