普通烟草NtNDPK4基因的克隆与表达分析

李泽锋，张佩佩，翟 妞，徐国云，郑庆霞，刘萍萍，周会娜，张 慧

中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

核苷二磷酸激酶（Nucleoside diphosphate kinase，NDPK）是一类广泛存在于各种生物体内的高度保守的核苷酸代谢重要蛋白［1］。主要通过催化介导磷酸基团转移，维持三磷酸核苷（Nucleoside triphosphate，NTP）和 三 磷 酸 腺 苷（Adenosine triphosphate，ATP）浓度平衡，因而与生物合成代谢、非生物胁迫、感病应激、光合作用和生物体能量代谢等息息相关［2］。长期以来，NDPK 蛋白的研究主要集中在哺乳动物，植物NDPK 蛋白的研究起步较晚。最早人们从豌豆中分离获得第一个植物NDPK蛋白［3］，随后又陆续从拟南芥、水稻、菠菜、番茄和白菜等植物中分离鉴定出多个NDPK蛋白［4-8］。目前植物NDPK 共有4 种类型，即为NDPKⅠ、NDPKⅡ、NDPKⅢ和NDPKⅣ。除NDPKⅣ功能尚不明确外，其余3类NDPK蛋白都具有多种生物学功能［2］。

NDPKⅡ主要参与活性氧清除、生长素调节和植物光合作用。拟南芥中AtNDPK2 能够与MAPK 相互作用清除活性氧，同时在叶绿体功能和生长素信号转导中都发挥重要作用［9］。拟南芥Atndpk2突变体在红光和远红光下都表现出子叶不能张开和变绿的缺陷，即该基因参与了叶片的光形态建成［10］。在水稻中发现NDPK2可以调控其他相关基因的转录水平进而影响叶绿体发育和叶绿素的生物合成［11-12］。将拟南芥AtNDPK2 在毛果杨中过量表达后植株的抗盐、抗旱能力显著增强，且转基因植株中生长素相关的吲哚乙酸基因表达量显著升高［13-14］。同样苜蓿中过表达AtNDPK2基因后在不同非生物胁迫条件下均可提高苜蓿的生物量和产量［15］。近年来，植物核苷二磷酸激酶受到广泛关注［16-18］。烟草是我国一种重要的经济作物，研究表明非生物胁迫对其生长发育及品质影响较大［19-20］。本研究中在普通烟草K326中克隆、鉴定了NtNDPK4基因，利用生物信息学的方法对NtNDPK4 蛋白的理化性质、亚细胞定位、磷酸化位点、进化关系及顺式作用元件等进行了系统分析，同时利用qPCR方法检测了NtNDPK4基因的组织表达特异性及激素和光照处理响应中的表达模式，旨在为进一步探明烟草NtNDPK4基因的功能及作用机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

普通烟草K326 于2021 年种植在国家烟草基因研究中心的人工气候室，采集盛花期烟株的根、茎、叶（中部叶）和花（花瓣、花萼、雄蕊和雌蕊）等组织器官，经液氮速冻后，-80 ℃冰箱保存备用。

激素处理和光照处理的K326 烟苗种植于光照培养箱，培养条件：温度（26±1）℃，相对湿度60%±2%，16 h光照培养，8 h黑暗培养。

激素处理方法：K326 种子经75%酒精消毒1～2 min 后用10% NaClO 消毒10 min，用灭菌水反复冲洗3～5次，在1/2 MS固体培养基上播种。幼苗长出4 片真叶后移栽至1/2 Hoagland 营养液中，待6 片真叶长出后选取长势均匀的幼苗进行外源激素处理，即在Hoagland营养液中分别加入各种激素。处理激素有茉莉酸甲酯（MeJA）、脱落酸（ABA）、独角金内酯类似物（GR-24）、生长素（IAA）、水杨酸（SA）、赤霉素（GA）和细胞分裂素（6-BA）。其中，MeJA的浓度是100 μmol/L，其余激素浓度是10 μmol/L。处理6 h后取样，每个处理设置3次生物学重复，每个重复选取3株幼苗，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。

光照处理方法：种子消毒和播种方法同上。播种后，留下对照平板正常光照下培养（简称光照），其余平板用锡箔纸包裹避光后在同样环境下培养。5 d后，将避光培养的平板去除锡箔纸放于光照下正常培养（留取一直避光的样品作为黑暗对照，简称黑暗），于恢复光照后2、6、12、24和48 h分别取样，48 h时对光照和黑暗样品也进行取样，每个处理取3个平板，每个平板取大小一致的烟草幼苗10株，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存备用。

1.2 试验方法

1.2.1 烟草总RNA提取及cDNA合成

采集幼苗期的烟草叶片，使用RNAprep Pure 多糖多酚植物总RNA 提取试剂盒［天根生化科技（北京）有限公司］提取烟草总RNA，测定浓度后，根据罗氏第一链cDNA 合成试剂盒（Transcriptor first strand cDNA synthesis Kit）说明书对其进行反转录，获得cDNA。

1.2.2 烟草NtNDPK4基因克隆

从中国烟草基因组数据库4.0 网站上获取NtNDPK4基因的CDS序列，用Primer Premier 5设计PCR扩增引物（上游引物NtNDPK4_F：5'- TGGGCAT CGATACGGGATCCATGGAGGGTCTTACCAT -3'，下游引物NtNDPK4_R：5'- TTCATCTGCAGCTCGA GCTCTTATTCCATCAACCAAGG -3'）。以烟草叶片的cDNA为模板进行扩增，PCR反应总体系50 μL：

5×PrimeSTAR GXL buffer 10 μL，dNTP Mixture 6 μL，cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，PrimeSTAR GXL DNA Polymerase 1 μL，ddH2O 补至50 μL。PCR 反应程序：98 ℃变性10 s，55 ℃退火15 s，68 ℃延伸30 s，30个循环。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA 纯化试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］对目的片段进行回收，回收得到的产物用In-Fusion试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］连接至pGAD载体并转化DH5α大肠杆菌感受态（北京全式金生物有限公司），37 ℃培养过夜。阳性克隆经测序正确后提取阳性克隆质粒。

1.2.3 生物信息学分析

使 用NCBI ORF Finder（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder）对序列ORF 进行查找，之后使用EMBOSS Transeq（http：//embossgui.sourceforge.net/demo/transeq.html）将其翻译为氨基酸序列；使用ProtParam（ExPASy-ProtParam tool）对蛋白理化性质进行预测；分别采用TMHMM 2.0［21］（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）和SignalP 6.0［22］（SignalP-6.0-Services-DTU Health Tech）对蛋白跨膜结构域、信号肽进行预测；运用DeepLoc-1.0［23］（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepLoc-1.0）进行亚细胞定位预测；使用NetPhos［24］（NetPhos-3.1-Services-DTU Health Tech）对蛋白磷酸化位点进行预测；通过SOPMA［25］（NPS@ ：SOPMA secondary structure prediction（ibcp.fr））进行蛋白二级结构预测；基于在线工具PlantCARE［26］（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）对启动子区域（上游2 Kb）顺式作用元件进行搜索；同源序列使用MUSCLE［27］（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/）进行联配，利用MEGA 7.0［28］构建系统进化树。

1.2.4 烟草NtNDPK4基因表达定量分析

以烟草不同组织、不同激素处理及黑暗处理后恢复光照的样品cDNA 为模板，用qPCR 的方法检测烟草NtNDPK4 基因的表达量。设计NtNDPK4基因的qPCR 引物（上游引物RT-NtNDPK4_F：5'-CACCATAGACCTCCTATT-3'，下 游 引 物 RTNtNDPK4_R：5'-TCCATCAGGCTTAATCAT-3'），使用Roche LightCycler 96 实时荧光定量PCR 仪进行qPCR 实验。内参基因选择烟草的26S rRNA基 因［29］，该基因的qPCR 引物上游序列26S_F：5'- GAAGAAGGTCCCAAGGGTTC-3'，下 游 序 列26S_R：TCTCCCTTTAACACCAACGG-3'。反应总体系20 μL（10 μL 2 × SYBR I Master，上下游引物各0.5 μL，50 ng 的cDNA，加ddH2O 补至20 μL），反应程序：94 ℃预变性30 s；94 ℃变性5 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45 个循环。每个样品3 次重复。根据循环阈值（Ct值），用2-ΔΔCt方法计算基因的相对表达量。

2 结果与分析

2.1 烟草NtNDPK4基因的克隆

以烟草K326 的幼苗叶片cDNA 为模板，PCR 扩增后的产物经琼脂糖电泳检测如图1所示。测序表明该片段长678 bp，编码225 个氨基酸，将其命名为NtNDPK4。

图1 NtNDPK4基因的电泳图Fig.1 Electrophoretogram of NtNDPK4 gene

2.2 烟草NtNDPK4蛋白生物信息分析

基于植物中已发表的NDPK 蛋白质序列，利用MEGA 7.0 构建系统进化树。结果如图2 所示，NtNDPK4属于NDPKⅡ类型，与烟草NtNDPK2关系最近。进一步将NDPKⅡ类型蛋白序列进行联配发现，NtNDPK4与其他NDPKⅡ相似性较高，在序列上较为保守（图3）。

图2 植物NDPK蛋白的进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of NDPK proteins in selected plants

图3 不同植物NDPKⅡ蛋白序列比对Fig.3 Alignment of NDPKⅡprotein sequences in different plants

分析发现NtNDPK4 蛋白分子量大小24.95 kDa，等电点8.34，正电荷氨基酸残基数（Arg+Lys）24个，负电荷氨基酸残基数（Asp+Glu）22 个。该蛋白不存在跨膜区且无信号肽，属于胞内蛋白。亚细胞定位预测NtNDPK4 定位于叶绿体基质的可能性最大。磷酸化位点预测发现：11个丝氨酸磷酸化位点，分别是S15、S21、S22、S25、S30、S54、S73、S99、S130、S193 和S195；4 个苏氨酸磷酸化位点，分别是T19、T109、T176 和T185；3 个酪氨酸磷酸化位点，分别是Y81、Y125 和Y140。二级结构预测发现，NtNDPK4包含4 种结构形式，其中随机卷曲88 个（占比39.11 %）、α螺旋79 个（占比35.11 %）、延伸链44 个（占比19.56 %）、β折叠14个（占比6.22 %）。

为进一步了解NtNDPK4 基因的功能，对NtNDPK4 基因顺式作用元件进行了预测，结果如表1 所示，该基因启动子区域含有激素响应相关元件，如 ABRE、TGACG-motif、P-box、CGTCA-motif、TCA-element和AuxRR-core等。同时也包含光响应相关元件，如G-box、Box 4、chs-CMA1a和AT1-motif等。另外还有一些其他元件，如生长发育相关元件circadian，逆境胁迫相关元件ARE、MBS、LTR 和GC-motif等。

表1 NtNDPK4启动子顺式作用元件统计Tab.1 Statistics for cis-acting elements of promoter of NtNDPK4

2.3 烟草NtNDPK4基因表达分析

为了检测烟草NtNDPK4基因在不同组织中的表达情况，分别以根、茎、叶和花等组织的cDNA为模板，qPCR结果（图4）表明，NtNDPK4基因在这些器官中都有表达，且根中的表达量显著高于茎、叶和花等组织。在花的各个器官中，花瓣中NtNDPK4基因的表达量最高。

图4 NtNDPK4基因在烟草不同组织中的表达量Fig.4 Expression levels of NtNDPK4 in different tissues of tobacco

为了检测烟草NtNDPK4基因在不同激素处理下的表达情况，分别用MeJA、ABA、GR-24、IAA、SA、GA 和6-BA 等7 种激素对K326 幼苗进行处理采样，qPCR 结果（图5）表明，除SA 和GR-24 外，NtNDPK4基因在其他激素处理样品中的表达量都显著提高（P＜0.05），尤其是受到GA的显著诱导（P＜0.01）。这表明NtNDPK4参与了激素应答响应。

图5 NtNDPK4基因在不同激素处理烟草中的表达量Fig.5 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different hormone treatments

为了检测烟草NtNDPK4 基因是否与光照有关，对烟草幼苗黑暗处理后恢复光照不同时间采集的样品利用qPCR 技术检测NtNDPK4 基因的表达量，结果如图6 所示。在恢复光照12 h 时，该基因被显著诱导（P＜0.05），24 h时该基因的表达量最高，说明该基因参与了光照响应。

图6 NtNDPK4基因在不同光照处理的烟草中的表达量Fig.6 Expression levels of NtNDPK4 in tobacco under different light treatments

3 讨论

从普通烟草K326克隆获得了1个烟草核苷二磷酸激酶基因NtNDPK4，该基因CDS 长度约678 bp，编码225个氨基酸。进化分析表明NtNDPK4与拟南芥AtNDPK2 和烟草NtNDPK2 同属NDPKⅡ型，这类NDPK 基因可能参与活性氧清除、生长素调节和植物光合作用等过程。亚细胞定位预测，NtNDPK4最有可能定位于叶绿体。顺式作用元件分析结果推测，NtNDPK4 可能参与激素响应和光照响应。进化分析及序列比对发现，烟草中有两个NDPKⅡ型基因，即NtNDPK2和NtNDPK4，两个基因编码的蛋白相似度约80%。NtNDPK2 可能参与活性氧的清除［30］，NtNDPK4 基因与NtNDPK2 基因是否有功能冗余，还有待进一步研究。

NtNDPK4 基因在烟草各个组织中都有表达，且根部表达相对较高。值得注意的是，该基因在花的各个器官中以花瓣中的表达最高，这一结果与中国白菜中的研究结果一致［8］。水稻［5］和杨树［13］中NDPK2基因则是在幼嫩的叶片中表达量最高。NDPKⅡ基因组织表达的多样性也预示着这些基因可能具有不同的功能。在拟南芥中，AtNDPK2 突变后下胚轴变短，生长素运输增强［9］。本研究中除生长素外使用了多种激素处理烟草幼苗，发现NtNDPK4 基因的表达受到了显著诱导，尤其是赤霉素处理后该基因的表达上调了近50 倍，但该基因在烟草GA 代谢中的重要作用仍有待进一步深入研究。与中国白菜BcNDK2 功能类似，NtNDPK4 的表达受到光照诱导，但该基因参与光照响应的具体机制有待深入探索。

4 结论

本研究中从栽培烟草K326 中克隆获得NtNDPK4 基因，进化分析发现该基因属于NDPKⅡ型。NtNDPK4基因在根、茎、叶和花中均有表达。在GA、IAA、6-BA、ABA 和MeJA 等 激 素 处 理 下，NtNDPK4 基因的表达量显著提高。同时，黑暗生长的烟草幼苗恢复光照12 h 后，NtNDPK4 基因表达明显上调。这表明该基因在烟草非生物胁迫中可能具有重要作用。