石见穿配方颗粒的特征图谱和含量测定

陈日荣 欧阳丽敏 杨佩雯 吴 弢

上海中医药大学中药研究所，上海 201203

石见穿为唇形科植物华鼠尾草Salvia chinensisBenth.的干燥地上部分，始载于《本草纲目》，“主骨痛，大风，痈肿”[1]。石见穿曾收录于《中华人民共和国药典》（1977年版），具有清热解毒、活血利气、止痛的功效，用于脘胁胀痛、痈肿等，此后历版《中华人民共和国药典》均未收录。现代药理研究表明，石见穿具有调控骨肉瘤细胞[2-3]和抗肝癌[4-5]等作用，临床上多应用于妇科疾病、癌症以及肝炎等的治疗。其化学成分研究表明，石见穿含有迷迭香酸、熊果酸、齐墩果酸等化合物[6-7]。在质量控制研究方面，文献报道有采用薄层光密度法测定其齐墩果酸的含量[8]，或用HPLC测定齐墩果酸和熊果酸的含量[9]，也有以迷迭香酸为指标建立石见穿药材质量标准[10-11]。大量研究表明迷迭香酸具有抗炎[12-13]、神经性保护[14]和抗神经痛等作用[15]，由此推测迷迭香酸的药理作用与石见穿清热解毒和活血止痛功效相关。中药配方颗粒是由单味中药饮片经提取浓缩制成的、供中医临床配方用的颗粒[16]。本研究以迷迭香酸为指标，对石见穿配方颗粒进行含量测定及其特征图谱进行研究，为石见穿配方颗粒的质量控制和临床合理应用提供科学依据。

1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity Ⅱ高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；AE200S型万分之一电子分析天平（上海梅特勒一托利多仪器有限公司）；BT25S型十万分之一电子分析天平（北京塞多利斯科学仪器有限公司）；KH-500E型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

丹参素（批号：wkq18061906）、原儿茶醛（批号：TO1013FB14）、咖啡酸（批号：B21243）、迷迭香酸（批号：Y16A9K6740），均购于上海源叶生物科技有限公司，含量均≥98%；石见穿配方颗粒由某医药公司送样。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

OSAKA SODA CAPCELL PAK C18 MG Ⅱ色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.0 μm）；柱温25℃；流动相A为乙腈，流动相B为0.1%甲酸溶液。梯度洗脱：0～10 min，5→20%A；10～22 min，20→23%A。进样量5 μl；流速1.0 ml/min；特征图谱检测波长：240 nm；含量测定检测波长：330 nm。

2.2 对照品溶液的制备

取迷迭香酸、丹参素、原儿茶醛及咖啡酸对照品适量，精密称定，置棕色量瓶中，加入甲醇制成1 mg/ml的迷迭香酸对照品溶液，和含丹参素0.20 mg/ml，原儿茶醛、咖啡酸及迷迭香酸均为0.05 mg/ml的参照物混合溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取石见穿配方颗粒0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入35%乙醇25 ml，称定重量，超声处理30 min，放冷，用35%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.4 石见穿配方颗粒特征峰的标定

吸取混合溶液与供试品溶液各5 μl，按“2.1”项下的色谱条件进样，色谱图见图1。根据对照供试品和参照物色谱图的保留时间，可以确认峰1（5.926 min）、峰3（8.937 min）、峰4（10.927 min）、峰5（19.335 min）分别为丹参素、原儿茶醛、咖啡酸和迷迭香酸。

图1 石见穿配方颗粒的HPLC特征图谱（240 nm）

2.5 方法学考察

2.5.1 专属性试验 按“2.3”项制备阴性样品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，结果见图1。结果表明辅料对特征图谱无影响，方法专属性良好。

2.5.2 精密度试验 取石见穿配方颗粒S1，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，计算相对峰面积。结果显示，RSD均小于1.83%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性试验 取石见穿配方颗粒S1，按“2.3”项制备6份样品，按“2.1”项色谱条件进样，计算相对峰面积。结果显示，RSD均小于1.69%，表明方法重复性良好。

2.5.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0、4、8、12、24、36、48和72 h连续进样3次，计算相对峰面积。结果显示，RSD均小于1.61%，表明方法稳定性良好。

2.6 石见穿配方颗粒特征图谱的建立及相似度评价

按“2.1”项色谱条件测定13批石见穿配方颗粒，将色谱图导入《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，采用全谱峰匹配，建立对照特征图谱R，见图2。计算相似度，10批石见穿配方颗粒S1～S10色谱图与对照图谱R的相似度均在0.90以上，表明其生产工艺稳定，质量均一性较好；而不同厂家的石见穿配方颗粒样品G1～G3的特征图谱与对照图谱R的相似度均在0.90以下，表明不同厂家生产的该配方颗粒在特征成分的种类和含量有明显的区别。

图2 13批石见穿配方颗粒的HPLC叠加特征图谱

2.7 迷迭香酸的含量测定

分别精密吸取迷迭香酸对照品溶液与供试品溶液各5 μl，按“2.1”项色谱条件进样，其色谱图见图3。结果显示，样品溶液中的峰1即为迷迭香酸。

图3 迷迭香酸对照品（A）和石见穿配方颗粒样品S1（B）的HPLC色谱图（330 nm）

2.8 迷迭香酸含量测定方法学考察

2.8.1 线性关系考察 取迷迭香酸对照品适量，精密称定，加入35%乙醇，摇匀，配制成迷迭香酸1 mg/ml的对照品储备液。吸取不同体积的对照品储备液，用35%乙醇稀释制成不同浓度的系列溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，以对照品的浓度（x）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标，建立回归方程：y=15539x+1.3366，r2=0.9998，线性范围为0.0035～0.0420 mg/ml。

2.8.2 精密度试验 吸取对照品溶液，按“2.1”项色谱条件，连续进样6次，测定迷迭香酸的峰面积，RSD为0.51%，表明仪器精密度良好。

2.8.3 重复性试验 取石见穿配方颗粒样品S1，按“2.3”项平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样，结果表明RSD为0.71%，表明方法重复性良好。

2.8.4 稳定性试验 取同一供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别于0、4、8、12、24、36、48和72 h分别进样3次，结果表明RSD为0.89%，供试品溶液在72 h内稳定性良好。

2.8.5 加样回收试验 精密称取已知含量的石见穿配方颗粒样品S1 0.25 g，共9份，其中每三份分别按照已知含量的50%、100%、150%加入对应迷迭香酸（0.992 mg/ml）对照品溶液，平行制备9份样品，按“2.1”项色谱条件分别进样，测定其峰面积，计算回收率（表1），结果表明平均加样回收率为100.87%，RSD为0.58%。

表1 迷迭香酸加样回收试验结果（n=3）

2.9 13批石见穿配方颗粒的含量测定

按照上面所建立的HPLC方法，对13批石见穿配方颗粒中迷迭香酸的含量进行了测定，结果见表2。其中10批石见穿配方颗粒样品S1～S10中迷迭香酸的含量范围为0.67～0.81 mg/g，均值为0.77 mg/g，按照含量均数±30%计算其含量波动范围。因此，拟定每1克石见穿配方颗粒中迷迭香酸的含量范围为0.54～1.00 mg。而三批不同厂家的样品G1～G3中迷迭香酸的含量差异较大，这与前面特征图谱相似度研究的结果一致，其范围为0.33～2.46 mg/g。

表2 石见穿配方颗粒中迷迭香酸的含量测定结果（n=3，mg/g，±s）

表2 石见穿配方颗粒中迷迭香酸的含量测定结果（n=3，mg/g，±s）

编号 迷迭香酸含量 编号 迷迭香酸含量S1 0.81±0.01 S8 0.78±0.01 S2 0.67±0.01 S9 0.77±0.02 S3 0.81±0.02 S10 0.78±0.01 S4 0.79±0.01 G1 1.80±0.01 S5 0.78±0.02 G2 0.33±0.03 S6 0.73±0.03 G3 2.46±0.03 S7 0.78±0.01

3 讨论

在制备供试品溶液时，对提取溶剂和提取时间进行了考察，比较了不同体积甲醇和乙醇及不同超声时间对特征图谱的影响，结果表明以35%乙醇超声30 min提取的样品，峰容量较大，各峰对称性较好，分离度较合适。

在建立特征图谱时，首先根据流动相的组成进行了优化。石见穿的主要成分为迷迭香酸、丹参素、原儿茶醛等[17]，因此尝试流动相组成中含有0.1%三氟乙酸、0.1%甲酸溶液、0.1%醋酸水等改善峰对称性[18-21]。结果发现使用乙腈-0.1%甲酸溶液的流动相系统进行梯度洗脱，分离效果好，且峰分布均匀。

由于迷迭香酸的药理作用与石见穿清热解毒和活血止痛功效相关，故选其作为含量测定的指标。迷迭香酸的检测波长[22-23]有320、325 nm等，本研究比较280、320、330、360 nm多个波长，结合峰形和分离度结果，选择330 nm为含量测定的最终检测波长。

丹参素的最大吸收波长为280 nm，300 nm之后无紫外吸收。当检测波长为330 nm时，丹参素无法检测；保留时间9.351 min（最大吸收波长为326 nm）的峰干扰峰3原儿茶醛（Rt=9.104 min）。当检测波长为240 nm时，杂质峰在240 nm只有微弱的紫外吸收，峰3原儿茶醛（最大吸收波长为230 nm）有较好吸收，干扰峰的吸收减弱；丹参素（峰1）能够被检测；同时特征图谱的五个峰分离效果好，且峰分布均匀，故选择240 nm为特征图谱的最终检测波长。

本研究建立了含丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸的特征图谱，揭示石见穿更多的共有峰成分，为进一步研究石见穿的成分提供了科学依据。由于经过提取浓缩等工艺，配方颗粒已无原有药材饮片的性状特征，加上中药产地和生产工艺等原因，使得中药配方颗粒的质量控制成为难点。所以质控指标仍选择迷迭香酸，多个成分的含量测定需要进一步的研究。