子宫肌瘤组织中miR-23、HIF-1α表达水平及其与细胞侵袭、上皮间质转化的相关性

曹 伟

江西省南昌市南昌县人民医院妇产科，江西南昌 330200

子宫肌瘤是育龄期女性最常见的良性肿瘤，且近年来其发病率逐年升高，发病人群趋于年轻化[1]。目前认为子宫肌瘤是一种雌激素依赖性肿瘤，雌激素水平过高可刺激细胞增殖、侵袭，但相关机制仍未完全明确[2]。低氧是实体肿瘤生存的微环境所具有的特征，而低氧诱导因子-1α(HIF-1α)是引起细胞低氧反应的关键核转录因子，可能参与子宫肌瘤发生、发展[3]。微小RNA(miRNA)是一类非编码RNA，调控细胞生长、增殖、凋亡等各种生理过程。研究表明，多种miRNA参与子宫肌瘤发生、发展过程[4]。miR-23是目前研究者们关注的焦点，研究显示，子宫肌瘤组织中miR-23呈低表达，可能参与子宫肌瘤的发生，但相关机制尚未完成明确[5]。基于此，本研究探讨了子宫肌瘤组织中miR-23、HIF-1α的表达水平及其与细胞侵袭、上皮间质转化(EMT)的相关性，旨在为子宫肌瘤发生、发展的机制研究提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2021年1月至2022年1月于本院行手术切除治疗的子宫肌瘤患者84例为研究对象，收集其切除的子宫肌瘤组织和正常肌层组织进行研究。纳入标准：经术后病理检查证实为子宫肌瘤；增生期患者，月经周期规律。排除标准：术前3个月使用过激素类药物；合并甲状腺功能减退或亢进症、糖尿病；合并心、肝、肾功能不全；合并卵巢肿瘤。患者年龄35～54岁，平均(47.28±5.84)岁。

1.2方法 术中收集子宫肌瘤组织及距子宫肌瘤0.5 cm以上的适量正常肌层组织，于-80 ℃冰箱储存。(1)miR-23、HIF-1α mRNA表达水平检测。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)进行检测，取适量标本，采用Trizol法提取组织总RNA(试剂盒购自上海名劲生物科技有限公司)，将总RNA反转录为cDNA。RT-qPCR反应以U6为内参，U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23上游引物5′-TCACACTATATCACATTGCCAGG-3，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；HIF-1α mRNA上游引物5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3′，下游引物5′-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3′，结果采用2-ΔΔCt法进行计算。(2)雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)表达情况检测。组织标本常规石蜡包埋切片，采用免疫组织化学法检测ER、PR表达情况，采用Sinicrope改良法进行结果判断，表达评分=染色细胞计数评分×染色强度评分，阴性：表达评分≤1分；弱阳性：表达评分2～3分；中度阳性：表达评分4～5分；强阳性：表达评分≥6分。(3)增殖基因、凋亡基因、侵袭基因、EMT标志基因表达水平检测。取适量标本，提取组织总蛋白，采用酶联免疫吸附试验试剂盒检测增殖基因[B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)]、凋亡基因[Bcl-2相关X蛋白(Bax)]、侵袭基因[基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9]、EMT标志基因[N-钙黏蛋白(N-cadherin)、E-钙黏蛋白(E-cadherin)]表达水平，将每毫克总蛋白中上述基因蛋白层面的表达水平作为其表达水平。

1.3观察指标 (1)比较子宫肌瘤组织及正常肌层组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平及ER、PR阳性率。(2)比较不同ER、PR表达情况子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平。(3)比较子宫肌瘤组织及正常肌层组织增殖、凋亡基因表达水平。(4)分析子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与增殖、凋亡基因表达水平的相关性。(5)比较子宫肌瘤组织及正常肌层组织侵袭基因、EMT标志基因表达水平。(6)分析子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与侵袭基因、EMT标志基因表达水平的相关性。

2 结 果

2.1子宫肌瘤组织与正常肌层组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平及ER、PR阳性率比较 子宫肌瘤组织miR-23表达水平低于正常肌层组织，HIF-1α mRNA表达水平及ER、PR阳性率高于正常肌层组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 子宫肌瘤组织及正常肌层组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平及ER、PR阳性率比较

2.2不同ER、PR表达情况子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平比较 ER、PR阳性子宫肌瘤组织miR-23表达水平分别低于ER、PR阴性子宫肌瘤组织，HIF-1α mRNA表达水平分别高于ER、PR阴性子宫肌瘤组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表2、3。

表2 不同ER表达情况子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1αmRNA表达水平比较

表3 不同PR表达情况子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平比较

2.3子宫肌瘤组织与正常肌层组织增殖、凋亡基因表达水平比较 子宫肌瘤组织Bcl-2表达水平高于正常肌层组织，Bax表达水平低于正常肌层组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 子宫肌瘤组织与正常肌层组织增殖、凋亡基因表达水平比较

2.4子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与增殖、凋亡基因表达水平的相关性 子宫肌瘤组织miR-23表达水平与Bcl-2表达水平呈负相关(P<0.05)，与Bax表达水平呈正相关(P<0.05)；子宫肌瘤组织HIF-1α mRNA表达水平与Bcl-2表达水平呈正相关(P<0.05)，与Bax表达水平呈负相关(P<0.05)，见表5。

表5 子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与增殖、凋亡基因表达水平的相关性

2.5子宫肌瘤组织与正常肌层组织侵袭基因、EMT标志基因表达水平比较 子宫肌瘤组织MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平高于正常肌层组织，E-cadherin表达水平低于正常肌层组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见表6。

表6 子宫肌瘤组织与正常肌层组织侵袭基因、EMT标志基因表达水平比较

2.6子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与侵袭基因、EMT标志基因表达水平的相关性 子宫肌瘤组织miR-23表达水平与MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平呈负相关(P<0.05)，与E-cadherin表达水平呈正相关(P<0.05)；子宫肌瘤组织HIF-1α mRNA表达水平与MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平呈正相关(P<0.05)，与E-cadherin表达水平呈负相关(P<0.05)，见表7。

表7 子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与侵袭基因、EMT标志基因表达水平的相关性

3 讨 论

子宫肌瘤可引起月经周期紊乱、痛经、盆腔压迫症状及生育能力低下，极大危害女性生殖健康和生活质量[6]。子宫肌瘤属于激素依赖性肿瘤，但至今其确切发病机制仍未完全阐明。因此，积极探索子宫肌瘤的发病机制，寻找有效的治疗靶点具有重要的临床价值。

miRNA属于非编码小RNA，通过结合下游靶基因使其沉默，进而在转录后精密调控下游靶蛋白。本研究利用RT-qPCR检测子宫肌瘤组织及正常肌层组织miR-23表达水平，结果显示，子宫肌瘤组织miR-23表达水平明显低于正常肌层组织，提示miR-23是在子宫肌瘤组织中表达明显失调的miRNA之一，与刘烜等[7]的研究结果一致。孕激素是诱发子宫肌瘤的重要内分泌因素，孕激素通过特异性结合PR，激活核内调节基因表达，参与子宫肌瘤的发生。有学者用Targetscan软件预测发现，PR基因是miR-23的靶基因之一[8]。且研究显示，子宫肌瘤组织中miR-23表达水平与PR亚型蛋白PRA表达水平呈负相关[9]，这可能是miR-23参与子宫肌瘤发生与发展的重要机制。在肿瘤组织微环境中缺氧普遍存在，HIF-1α是HIF-1亚单位，具有氧调节作用，在缺氧、炎症反应等情况下，其通过缺氧反应元件调控细胞凋亡、血管形成等生物学过程，增强机体对刺激的适应性[10]。有研究报道，HIF-1α mRNA在子宫肌瘤患者血清与组织中呈高表达，可能成为子宫肌瘤的潜在标志物[11-12]。本研究也发现类似结论，提示在子宫肌瘤发生、发展过程中，HIF-1α可能起重要作用。结合分子生物学功能，推测高表达的HIF-1α可能通过调控肿瘤血管生成、细胞凋亡、能量代谢等影响细胞增殖，进而引起子宫肌瘤的发生。雌、孕激素对子宫肌瘤生长具有促进作用，ER、PR与雌、孕激素亲和力高，可选择性保留较高水平雌、孕激素，加强其生物学效应[13]。本研究进一步分析发现，ER、PR阳性子宫肌瘤组织miR-23表达水平分别低于ER、PR阴性子宫肌瘤组织，HIF-1α mRNA表达水平分别高于ER、PR阴性子宫肌瘤组织，提示子宫肌瘤组织中miR-23、HIF-1α的表达与ER、PR有关。进一步说明miR-23、HIF-1α在子宫肌瘤发展中发挥作用。

多种增殖、凋亡基因在子宫肌瘤细胞增殖过程中起重要的调节作用。Bcl-2可通过线粒体途径使细胞生存时间延长，并增强细胞耐受外界刺激的能力，进而促进细胞增殖；Bax与Bcl-2是同源蛋白质，二者功能相互拮抗[14]。本研究显示，子宫肌瘤组织Bcl-2表达水平高于正常肌层组织，Bax表达水平低于正常肌层组织，与既往研究结果一致[15]，提示增殖、凋亡基因异常表达与子宫肌瘤形成密切相关。进一步分析子宫肌瘤组织miR-23、HIF-1α mRNA表达水平与上述基因的相关性发现，miR-23表达水平与Bcl-2表达水平呈负相关(P<0.05)，与Bax表达水平呈正相关(P<0.05)，HIF-1α mRNA表达水平与Bcl-2表达水平呈正相关(P<0.05)，与Bax表达水平呈负相关(P<0.05)。因此，推测子宫肌瘤组织miR-23低表达、HIF-1α mRNA高表达可能通过促进增殖基因表达、抑制凋亡基因表达而参与子宫肌瘤的发生与发展。

子宫肌瘤细胞侵袭性生长是引起子宫肌瘤病灶生长的关键环节[16]。MMP是导致细胞外基质降解与重构的主要酶类，其中MMP2、MMP9是降解Ⅳ型胶原酶的主要酶[17]。同时，细胞侵袭性生长还与EMT有关。EMT形成过程中，细胞由上皮表型转化为间质表型，细胞间极性降低，且细胞运动特性增强，利于细胞侵袭[18]。N-cadherin、E-cadherin分别是间质表型、上皮表型细胞标志分子，与EMT密切相关[19]。本研究显示，子宫肌瘤组织MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平高于正常肌层组织，E-cadherin表达水平低于正常肌层组织，提示MMP高表达及EMT加剧与子宫肌瘤发生和发展密切相关。进一步分析发现，子宫肌瘤组织miR-23表达水平与MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平呈负相关(P<0.05)，与E-cadherin表达水平呈正相关(P<0.05)；HIF-1α mRNA表达水平与MMP2、MMP9、N-cadherin表达水平呈正相关，与E-cadherin表达水平呈负相关(P<0.05)，说明子宫肌瘤组织miR-23低表达、HIF-1α mRNA高表达可促进MMP表达及EMT，促进细胞侵袭。

综上所述，miR-23低表达、HIF-1α高表达可能通过促进ER、PR高表达，细胞增殖、侵袭及EMT参与子宫肌瘤发生与发展。但miR-23、HIF-1α参与子宫肌瘤发生、发展的机制尚未完全阐明，如何相互促进、何为始发因素等问题仍有待后续研究进一步明确。