肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与其对抗菌药物敏感性的关系分析*

朱昱蓉，黄 晶，赵 君，江水明，刘荣华

山西省临汾市中心医院微生物实验室,山西临汾 041000

肺炎克雷伯菌是一种有荚膜的革兰阴性粗短杆菌，属于ESKAPE(包括革兰阳性肠球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、绿脓杆菌、肠杆菌)病原体的一员[1]。临床上肺炎克雷伯菌因高耐药率及高播散性成为引起院内外感染的重要病原菌[2]，2020年全国细菌耐药监测报告显示，分离的革兰阴性菌中，肺炎克雷伯菌占比(占革兰阴性菌的20.9%)仅次于大肠埃希菌(占革兰阴性菌的29.7%)，位居革兰阴性菌的第2位[3]。在国内，肺炎克雷伯菌感染所致肺炎占呼吸机相关肺炎和重症监护病房获得性肺炎的11.9%[4]。生物膜是细菌的一种保护机制，研究表明，肺炎克雷伯菌可聚集于导管或内置医疗器械表面形成黏稠的生物膜结构，常规清洗难以去除[5]。成熟的生物膜可保护细菌免受机体免疫系统杀伤，导致细菌对常规抗菌药物抗性增加1 000倍左右，可引起免疫受损者持续发生医院感染或难治性导管相关感染，大大增加了感染的难治程度。研究发现，肺炎克雷伯菌临床分离株生物膜形成率高达60%[6-7]。生物膜作为细菌耐药的一种重要机制，但目前其形成能力与肺炎克雷伯菌对抗菌药物敏感性关系的相关研究较少。因此，本研究选取住院患者送检标本中分离培养并鉴定的肺炎克雷伯菌菌株为研究对象，探究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与其对抗菌药物敏感性的关系，以期为医院感染的控制和用药指导提供理论依据。

1 材料与方法

1.1标本来源 收集2021-2022年本院住院患者送检标本中分离出的肺炎克雷伯菌菌株，剔除同一患者的重复菌株，采用纸片法将菌株保存于-80 ℃冰箱。质控菌株为肺炎克雷伯菌ATCC700603，购自山西省临床检验中心。

1.2仪器与试剂 血平板购自郑州人福博赛生物技术有限责任公司；LB液体培养基购自北京索莱宝科技有限公司；结晶紫染液购自珠海贝索生物技术有限公司；96孔细胞培养板购自美国Corning公司；药敏卡购自法国生物梅里埃公司；MH 琼脂粉购自杭州滨河微生物试剂有限公司；药敏纸片购自英国 Oxoid公司；一次性比浊管购自法国生物梅里埃公司。基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪购自江苏天瑞仪器股份有限公司；比浊仪、VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统购自法国生物梅里埃公司；VARIOSKAN LUX酶标仪、CO2培养箱购自美国赛默飞世尔公司。

1.3方法

1.3.1菌株鉴定及药敏试验 参照美国临床和实验室标准化协会(CLSI)2019相关标准，用传统方法培养、分离、纯化细菌，通过基质辅助激光解析电离飞行时间质谱仪进行菌株鉴定，采用VITEK-2 Compact全自动微生物鉴定及药敏分析系统联合纸片扩散(K-B)法分析菌株对抗菌药物的敏感性，采用双纸片协同扩散法检测菌株产超广谱β-内酰胺酶(ESBL)情况，具体操作细节和结果判读参照CLSI 2019相关标准进行。

1.3.2菌株生物膜形成能力检测 冻存菌株在血平板上复苏，培养16～18 h后用无菌棉签挑取3个单克隆菌落制备0.5麦氏浊度菌悬液，将200 μL LB液体培养基和20 μL 0.5麦氏浊度的菌悬液(阴性对照加入20 μL LB液体培养基，阳性对照为ATCC700603)接种于96孔细胞培养板中，96孔细胞培养板周围加入生理盐水保持湿度。将培养板置于35 ℃含5%CO2的培养箱中静置培养30 h；弃去LB液体培养基，并用灭菌双蒸水清洗3次，弃去游离细菌，随后加入甲醇固定10 min；每孔加入300 μL 1%结晶紫染液染色2 min，灭菌双蒸水清洗3次去除未结合染液；控干水分后每孔加入200 μL 95%乙醇充分溶解结晶紫染液，读取570 nm处吸光度值[1]。以吸光度值(阴性对照的平均吸光度值+3×标准差值)为临界值，大于该吸光度值则判定为形成生物膜。

1.3.3资料收集 收集检出菌株患者的临床资料，包括年龄、性别、标本类型、标本来源科室、侵入性操作情况等。侵入性操作是医疗过程中带有一定创伤性的检查或治疗措施，主要包括动静脉置管、呼吸机应用、留置导尿管或胃管、手术治疗、内窥镜检查、气管插管/切开、血液透析、CT/超声引导下穿刺、引流等。

2 结 果

2.1菌株临床特征 2021-2022年共收集肺炎克雷伯菌143株，其中耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(CRKP)1株，产ESBL菌株14株。143例患者平均年龄为(58.97±20.52)岁，其中女41例(28.67%)，男102例(71.33%)，男性占比高于女性，差异有统计学意义(P<0.05)。临床分离的菌株标本类型以痰液(84.62%)为主，在尿液、肺泡灌洗液、分泌物、全血、胸腔积液及其他标本中均有检出，但占比均低于10%。分离出肺炎克雷伯菌的科室中，以重症医学科(27.27%)和呼吸危重症科(26.57%)分离的菌株占比较高。31.47%的菌株来源患者进行了支架置入、脑血管造影等手术治疗。见表1。

表1 肺炎克雷伯菌临床分布情况

续表1 肺炎克雷伯菌临床分布情况

2.2菌株药敏试验结果 肺炎克雷伯菌对抗菌药物敏感性较高，检测的抗菌药物敏感率均>60%，1株CRKP对亚胺培南不敏感，14株产ESBL菌株均对第四代头孢菌素表现出不同程度耐药。对美罗培南敏感率最高(100.00%)，其次为亚胺培南(99.30%)。检测的3种氨基糖苷类抗菌药物中，肺炎克雷伯菌对丁胺卡那霉素的敏感率最高(97.20%)。肺炎克雷伯菌对第一代头孢菌素头孢唑林的敏感率为64.34%，对第二代头孢菌素头孢呋辛的敏感率为81.12%，对第三代头孢菌素头孢曲松(86.01%)、头孢他啶(92.31%)的敏感率较高。对氟喹诺酮类抗菌药物左氧氟沙星(88.11%)和环丙沙星(86.01%)敏感率均>85%。见表2。

表2 肺炎克雷伯菌药敏试验结果

2.3菌株生物膜形成能力检测结果 对吸光度值数据分析显示，在收集的143株菌株中，有111株可形成生物膜，32株无生物膜形成，生物膜形成率达77.62%。

2.4生物膜形成能力与对抗菌药物敏感性分析 111株生物膜形成菌株和32株无生物膜形成菌株药敏试验结果表明，生物膜形成菌株对头孢曲松、头孢吡肟和头孢呋辛的不敏感率与无生物膜形成菌株比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与对抗菌药物敏感性分析结果

续表3 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力与对抗菌药物敏感性分析结果

2.5产ESBL菌株与生物膜形成能力的关系 产ESBL菌株生物膜形成率达85.71%(12/14)，非产ESBL菌株生物膜形成率为76.74%(99/129)，二者生物膜形成率比较，差异无统计学意义(χ2=0.585，P=0.444)。

2.6重症医学科、呼吸危重症科和其余科室分离的肺炎克雷伯菌对抗菌药物敏感性的差异分析 对抗菌药物敏感性分析表明，医院其余科室分离的肺炎克雷伯菌与重症医学科和呼吸危重症科分离的肺炎克雷伯菌对所检测抗菌药物的不敏感率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。重症医学科分离的肺炎克雷伯菌对复合制剂(哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦 )和米诺环素的不敏感率低于呼吸危重症科分离的肺炎克雷伯菌，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 重症医学科、呼吸危重症科和其余科室分离的肺炎克雷伯菌对抗菌药物敏感性分析结果

2.7重症医学科、呼吸危重症科和其余科室分离的肺炎克雷伯菌产ESBL和生物膜形成能力分析 重症医学科、呼吸危重症科和其余科室产ESBL肺炎克雷伯菌分别占7.69%、5.26%和13.64%，产ESBL菌株占比在上述科室间比较，差异无统计学意义(P>0.05)。重症医学科、呼吸危重症科和其余科室分离的肺炎克雷伯菌中有生物膜形成的菌株分别占79.49%、73.68%和78.79%，上述科室中有生物膜形成的菌株占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表5。

3 讨 论

肺炎克雷伯菌是临床常见致病菌，分离率约占克雷伯氏菌属的95%，是耐药和毒力基因在革兰阴性菌与环境之间传播的媒介，可导致医院感染或社区感染的发生，严重威胁患者健康[8]。在抗菌药物的选择压力下出现了产ESBL肺炎克雷伯菌和CRKP[9]。全国细菌耐药检测报告显示，肺炎克雷伯菌分离率占全部菌株的13%～14%，且对抗菌药物敏感性较高，CRKP检出率也呈上升趋势[3]。肺炎克雷伯菌多造成呼吸系统感染，在呼吸机相关肺炎中常见，吸烟、饮酒及呼吸系统基础疾病(如慢性阻塞性肺疾病等)均为其感染的危险因素[10]。本研究结果表明，肺炎克雷伯菌感染患者中男性多于女性，这可能与本研究入组患者中男性吸烟、饮酒的比例较高相关。菌株对抗菌药物敏感性分析发现，分离的肺炎克雷伯菌对检测的抗菌药物敏感率较高，均>60%，与全国细菌耐药监测报告结果基本一致[3]。本研究结果表明，重症医学科来源的菌株对抗菌药物敏感性整体较呼吸危重症科高，这可能与不同科室间治疗药物使用及患者基础状况不同有关，有待深入探究。全国细菌耐药监测报告显示，我国CRKP检出率呈逐年上升趋势，而本研究仅检出1株CRKP，这可能与本院感染防控工作开展效果较好和耐药菌株在全国的地域分布差异有关。

随着细菌耐药情况的加剧，对菌株耐药机制的研究也逐步深入，目前已知的细菌耐药机制包括耐药基因的携带、菌株外膜蛋白、菌株外排泵、整合子基因盒和菌株生物膜形成等[5]。随着对细菌生物膜相关研究的深入，研究者发现生物膜形成能力与菌株耐药性密切相关，菌株生物膜形成严重影响临床抗感染治疗的效果及患者预后[11]。细菌生物膜是细菌在营养等条件不足的情况下形成的一种黏附在物体表面或气液交界面的膜性结构，内部包裹着大量菌落，是细菌的天然保护屏障，在细菌存活、菌株间信息交流、细菌免疫及对抗菌药物不敏感方面发挥着重要的作用，是引起临床难治性感染的主要因素[12]。目前的研究表明，细菌生物膜形成主要分为3个阶段，第一阶段主要是细菌附着于导管等基质物体表面，该基质可辅助菌株逃避机体免疫系统杀伤，随后菌株分泌细胞外多糖物质，生物膜形成进入不可逆的第二阶段，多糖物质累积到一定程度后生物膜形成进入第三阶段，活性菌株包被在复杂的生物分子层内[13]。生物膜可通过药物渗透限制和菌株营养限制等机制导致菌株对常规抗菌药物的抗药性增加约1 000倍，大大增加了感染的难治程度[14]。本研究发现，本院肺炎克雷伯菌生物膜形成率达77.62%，与国内学者的报道相近[7,15]，重症医学科、呼吸危重症科、其余科室间有生物膜形成的菌株占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示临床各科室均应密切关注有生物膜形成菌株的感染情况，尤其是进行留置导管等侵入性操作患者的感染情况。对抗菌药物敏感性分析发现，生物膜形成菌株对头孢曲松、头孢吡肟和头孢呋辛的不敏感率较无生物膜形成菌株高(P<0.05)，提示细菌生物膜的形成可能是菌株对头孢类抗菌药物耐药的机制，有待进一步研究。生物膜形成菌株对部分头孢类抗菌药物的高耐药性会给临床治疗带来挑战，因此在患者发生肺炎克雷伯菌感染时应重点关注菌株生物膜形成能力，选择合适的治疗药物，避免生物膜形成所致导管或其他侵入性操作相关的难治性感染。研究显示，产ESBL的肺炎克雷伯菌在世界范围内达50%的覆盖率，社区的分离率达30%[5]，碳青霉烯类药物是治疗产ESBL菌株感染的首选药物，控制产ESBL菌株的流行至关重要。本研究共检出14株产ESBL肺炎克雷伯菌， 重症医学科、呼吸危重症科和其余科室产ESBL肺炎克雷伯菌占比比较，差异无统计学意义(P>0.05)。有学者报道，ESBL与肺炎克雷伯菌生物膜形成密切相关[7]，但本研究数据显示，产ESBL菌株与非产ESBL菌株生物膜形成能力无明显差异，本研究结果与上述研究结果存在一定差异可能与不同研究菌株的地域分布差异有关，也可能与本研究纳入菌株数较少有关。

综上所述，本院分离的肺炎克雷伯菌生物膜形成率较高，这使临床感染治疗面临极大的挑战，应引起临床重视。生物膜形成直接影响菌株对抗菌药物的敏感性，关于其耐药机制的研究可为抗感染治疗提供新的靶点，为新药研发提供新的思路。建议临床开展广泛监测，对于有肺炎克雷伯菌感染并进行了侵入性操作的患者应预防生物膜形成。临床上应完善抗菌药物使用规范，重点关注有生物膜形成菌株的感染情况，合理使用抗菌药物。但由于本研究纳入的菌株数有限，CRKP菌株和产ESBL菌株较少，使本研究结果可能存在一定偏倚，后续将继续收集菌株，为感染控制措施的制订和院内感染控制提供参考依据。