Leptin与CXCL4在阿尔茨海默病发展进程中的作用研究*

田 甜，韦 静，吕宏祥

1.南京医科大学附属江宁医院神经内科，江苏南京 211100；2.南京医科大学附属南京医院检验科，江苏南京 211100；3.南京医科大学附属江宁医院检验科，江苏南京 211100

阿尔茨海默病(AD)是老年人群进行性痴呆的最常见病因，AD的组织学特点是β淀粉样蛋白(Aβ)在细胞外斑块上沉积，以及在细胞内神经纤维缠结中过度磷酸化tau蛋白聚积[1-3]。研究表明，AD患者中肥胖可能先于痴呆出现，并且会引起瘦素(Leptin)和胰岛素抵抗[4]。Leptin是一种在脂肪组织中合成的肽激素，其可以通过自分泌、旁分泌和内分泌的作用机制去影响外周和中枢神经系统的自我保护过程；Leptin的生物学活性主要依赖表达于各个组织器官的表面受体，其在维持葡萄糖稳态、免疫稳态、血管生成、造血、生殖中均发挥重要的作用[4]。AD作为一种慢性神经退行性疾病，各种炎症反应和细胞因子也参与其发展进程，亦有数据证实巨噬细胞作为高度异质性的细胞群体，根据局部微环境的改变其可进行自身功能重塑(极化为M1/M2型巨噬细胞)，参与AD的发展进程[5]。研究发现，CXC趋化因子配体4(CXCL4)作为一种由活化血小板和免疫细胞产生的趋化因子，可参与肿瘤[6]、感染[7]和炎症反应相关疾病(系统性硬化症、类风湿关节炎和银屑病关节炎)[8]等的进展。目前，Leptin与CXCL4在肿瘤、炎症反应相关疾病中的作用及与这些疾病关系的报道较少。本研究以AD患者作为研究对象，探讨Leptin与CXCL4在AD发展进程中的作用。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2022年1-4月在南京医科大学附属江宁医院住院的AD患者30例为AD组，其中男20例，女10例；平均年龄(76.43±2.20)岁。纳入标准：年龄60～95岁；血尿便常规、肝肾功能等均无异常。另选择同期60～95岁的健康体检者10例为健康对照组，其中男4例，女6例；平均年龄(75.50±3.79)岁。AD组与健康对照组性别、年龄比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准。

1.2仪器与试剂 人磷酸化tau-181蛋白(p-tau-181)检测试剂盒、人β淀粉样蛋白1-42(Aβ1-42)检测试剂盒(深圳市安群生物工程有限公司)，Leptin、CXCL4 酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司)，cDNA反转录试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司)，CXCL4单克隆抗体(美国Proteintech公司)，CXCL4引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]，DMEM培养基、胎牛血清(以色列 Biological Industries公司)。Jet-iStar 3000免疫分析仪(中翰盛泰生物技术股份有限公司)，凝胶电泳仪、全自动酶联免疫分析仪(美国Bio-Rad公司)，PCR扩增仪、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)扩增仪(美国ABI公司)，电泳凝胶成像分析系统(美国阿尔法公司)，倒置相差显微镜(日本Olympus公司)。小鼠RAW264.7巨噬细胞系购自ATCC细胞库。

1.3方法

1.3.1临床资料收集 收集AD组与健康对照组体质量、血葡萄糖(Glu)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)、甘油三酯(TG)等临床资料。

1.3.2标本收集 采用促凝管收集AD组与健康对照组外周血2 mL，静置10～20 min后放置于低速台式离心机中以3 000 r/min离心15 min，收集上层血清，置于-80 ℃冰箱保存待测，避免反复冻融。

1.3.3细胞培养与处理 小鼠RAW264.7巨噬细胞系在37 ℃、5%CO2培养条件下培养，正常换液与传代，选取对数生长期的细胞铺板，分别设置对照组(不进行任何处理)与处理组(用50 ng/mL Leptin处理)，在处理6、12 h时收集细胞用于相关检测。

1.3.4ELISA检测血清Aβ1-42、p-tau-181、Leptin及CXCL4表达水平 将收集的研究对象血清标本吸取100 μL加入反应孔中，37 ℃温育60 min后弃去反应孔中液体，加入洗涤液洗板5次，拍干后每孔加入100 μL结合抗体，37 ℃温育30 min，洗板拍干后加入100 μL辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗体，用封口膜封板，37 ℃温育30 min，用洗涤液反复洗5次，分别加入底物显色，15 min后加入终止液，用酶标仪(450 nm)进行检测。

1.3.5蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测巨噬细胞CXCL4蛋白表达水平 收集对照组与处理组Leptin处理6、12 h的小鼠巨噬细胞于1.5 mL的EP管中，1 mL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬并洗涤细胞3次，每次5 min，随后加入含有1 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)的细胞裂解液RIPA，充分裂解后12 000×g离心5 min，收集上清液并以4∶1的比例加入5×loading buffer后置于金属浴中100 ℃ 10 min。使用12%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离不同分子量的蛋白，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用1%胎牛血清清蛋白室温封闭1 h，CXCL4(1∶1 000)4 ℃孵育过夜后用1×TBST洗涤3次，每次10 min，用HRP标记的羊抗小鼠或兔二抗室温孵育1 h。β-actin作为内参(1∶5 000)，最后加入ECL发光液观察目的蛋白的表达。

1.3.6RT-qPCR检测巨噬细胞CXCL4 mRNA表达水平 收集对照组与处理组Leptin处理6、12 h的小鼠巨噬细胞于1.5 mL的EP管中，1 mL PBS重悬并洗涤细胞3次，每次5 min，随后加入Trizol Reagent提取总RNA，根据说明书反转录成cDNA，采用RT-qPCR检测CXCL4 mRNA表达水平，以GAPDH作为内参。扩增条件：95 ℃预变性15 s， 95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40个循环。CXCL4 mRNA的相对表达水平用2-ΔΔCt法计算。

2 结 果

2.1AD组与健康对照组临床资料比较 AD组体质量、Glu、HDL、LDL、TG水平与健康对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2AD组与健康对照组血清Aβ1-42、p-tau-181表达水平比较 AD组血清Aβ1-42表达水平为(225.6±20.78)pg/mL，p-tau-181表达水平为(39.80±2.10)pg/mL，均明显高于健康对照组的Aβ1-42[(52.64±7.92)pg/mL]、p-tau-181[(15.01±1.75)pg/mL]表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1A、1B。

表1 AD组与健康对照组临床资料比较

注：A为AD组与健康对照组血清Aβ1-42表达水平比较；B为AD组与健康对照组血清p-tau-181表达水平比较；两组比较，*P<0.05。

2.3AD组与健康对照组血清Leptin、CXCL4表达水平比较 AD组血清Leptin表达水平为(186.1±15.03)pg/mL，CXCL4表达水平为(99.41±11.07)pg/mL，均明显低于健康对照组Leptin[(283.2±13.71)pg/mL]、CXCL4[(151.0±25.95)pg/mL]表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2A、2B。

注：A为AD组与健康对照组血清Leptin表达水平比较；B为AD组与健康对照组血清CXCL4表达水平比较；两组比较，*P<0.05。

2.4Leptin调控巨噬细胞中CXCL4的表达 与对照组比较，处理组Leptin处理6、12 h能明显上调CXCL4蛋白表达水平，处理6 h能明显上调CXCL4 mRNA表达水平，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3A、3B。

注：A为对照组与处理组Leptin处理6、12 h的CXCL4蛋白表达水平比较；B为对照组与处理组Leptin处理6、12 h的CXCL4 mRNA表达水平比较；与对照组比较，*P<0.05。

2.5AD患者血清Leptin表达水平与CXCL4表达水平的相关性分析 Pearson相关分析结果显示，AD患者血清Leptin表达水平与CXCL4表达水平呈正相关(r=0.445，P<0.05)。见图4。

图4 AD患者血清Leptin表达水平与CXCL4表达水平的相关性

3 讨 论

AD最初的症状是与海马病变相关的情景性记忆丧失[9]。但近年来研究也发现，一些与肥胖相关的病理改变，如神经性炎症、胰岛素抵抗或线粒体功能障碍也可以出现在AD的病理进程中[10]。流行病学研究中也同样有证据表明，体质量变化与AD有关，中年肥胖增加了AD的发生风险，且在AD早期阶段患者存在体质量减轻[11]。本研究对纳入的AD组和健康对照组的临床资料进行比较，两组体质量、Glu、HDL、LDL、TG水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，提示纳入的AD患者不存在其他指标异常导致的AD进展。

Leptin是一种由脂肪细胞合成和分泌的激素，主要由白色脂肪组织分泌，少量由棕色脂肪组织分泌[12]。Leptin通过血脑屏障后作用于下丘脑，发挥调节进食行为和能量消耗的作用。研究表明，Leptin对海马的发育和功能影响较明显，Leptin可以促进海马突触的可塑性，包括促进神经发生和突触传递[11]。此外，在衰老和AD的动物模型中也发现，通过喂养和锻炼来维持脂肪组织中的能量平衡，可以改善认知功能并防止与年龄相关的学习能力下降[13]；也有研究表明，Leptin的神经保护活性主要表现在其可通过抑制淀粉样蛋白的生成，降低tau蛋白的磷酸化水平来改善认知功能[14]。Leptin除了在调节系统代谢和食欲方面具有良好的作用外，在免疫细胞功能调节中也同样发挥关键作用，如许多免疫细胞(T、B淋巴细胞及巨噬细胞等)已经被证明可以直接通过与其表面的Leptin受体结合发挥生物学活性，进而参与肿瘤、病毒感染及自身免疫性疾病的发生[15]。巨噬细胞作为一群功能异质性的细胞群体参与多种炎症反应相关疾病的发展进程，而AD作为一种慢性神经退行性疾病，各种炎症反应参与其病理变化。已有报道显示，AD患者中M2b型巨噬细胞亚群的减少会下调其认知功能，同时本课题组前期研究也发现Leptin能够调节巨噬细胞功能重塑，参与自身免疫性心肌炎的发展进程[16]。由此推测，Leptin能够调节巨噬细胞向M2型极化，参与AD的发展。

CXCL4又称血小板因子，是最早被发现的趋化因子家族成员，其储存在血小板分泌的颗粒中，在蛋白激酶C和Rac1激活时释放[6]。研究显示，CXCL4具有一定的趋化功能，且参与自身免疫性疾病、肿瘤及炎症反应相关疾病的发生[7-8]，而关于CXCL4在AD发展进程中的作用报道较少。本研究发现，AD患者血清Leptin表达水平降低的同时伴有CXCL4表达水平的降低，并且本研究在细胞水平证实了Leptin能够调节CXCL4的表达。由此说明，Leptin能够通过调节CXCL4的表达在AD发展进程中发挥重要作用。

综上所述，AD患者血清Aβ1-42、p-tau-181表达水平升高，Leptin、CXCL4表达水平降低，Leptin能够调控CXCL4的表达。在接下来的研究中本课题组将进一步探讨在AD发展进程中Leptin调控CXCL4表达的具体机制，以期为AD患者的治疗提供新的思路。