高效液相色谱法测定不同产地拳参中没食子酸、儿茶素、绿原酸的含量

任增良，唐连祥，王永兵

（湖州中科营养与健康创新中心，浙江省 湖州市 313000）

中药拳参为蓼科多年生草本植物拳参（Polygonum bistortaL.）的根茎［1］，具有清热解毒、消肿止血之功效，用于赤痢、热泻、肺热咳嗽、痈肿、口舌生疮、吐血、痔疮出血、毒蛇咬伤等症。研究表明，拳参主要药理作用有抗炎抑菌［2］、抗氧化［3］、抗肿瘤［4］、保护心血管系统［5］等。拳参中含有丰富的酚类化合物，其中代表性的有没食子酸、儿茶素、绿原酸等［6］，这些酚类成分大多具有抗病原微生物、抗氧化的作用［7，8］，可作为评价拳参质量的指标性成分。

2020年版《中国药典》中采用没食子酸作为拳参含量测定的检测指标成分。由于中药成分的复杂性及药理作用的多样性，多成分的检测更符合中药整体作用的特点。基于此，本研究建立同时测定拳参中没食子酸、儿茶素和绿原酸3个指标性成分含量的高效液相色谱法，以期为拳参质量评价提供参考。

1 仪器与试剂

岛津LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Shimadzu Inertsil ODS-SP色谱柱（4.6 mm ×150 mm， 5 μm）；BT 25S 十万分之一分析天平（德国赛多利斯公司）；KH-500DB超声提取器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4数显恒温水浴锅（国华电器有限公司）。

没食子酸对照品（批号：C17D10C105977，纯度98%，上海源叶生物科技有限公司）；儿茶素对照品（批号：P21J11F118380，纯度98%，上海源叶生物科技有限公司）；绿原酸对照品（批号：MUST-19030620，纯度99.39%，成都曼斯特生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、乙醇均为色谱纯；磷酸为分析纯；水为超纯水。

从多个主产区收集得到18批拳参药材，经南京中医药大学杨念云教授鉴定为蓼科植物拳参（Polygonum bistortaL.）的干燥根茎。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Shimadzu Inertsil ODS-SP （4.6 mm ×150 mm， 5 μm）；流动相：0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱程序：0～5 min，0 → 1% B；5～10 min，1% → 5% B；10～40 min，5% → 8% B，柱后运行10 min回到起始梯度；流速：0.8 mL/min；检测波长：0～32 min，270 nm；32～40 min，325 nm；进样体积：5 μL；柱温：40 °C。对照品溶液、供试品溶液色谱图见图1。

图1 对照品溶液（A）和供试品溶液（B）的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of reference solution（A）and sample solution（B）

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取没食子酸、儿茶素和绿原酸对照品适量，置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，得到浓度分别为0.448 mg/mL、0.414 mg/mL和0.842 mg/mL的混合对照品储备液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称定0.6 g拳参粉末（过60目筛），置于具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定重量，超声处理（功率：140 W，频率：100 kHz）40 min，冷却至室温后补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察

精密吸取“2.2”项下各对照品储备液，用甲醇逐步稀释，配成系列浓度梯度。精密吸取上述各溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积，以对照品的进样浓度为横坐标X，峰面积为纵坐标Y，绘制标准曲线，得回归方程、相关系数（r）和线性范围，将对照品溶液浓度稀释至约3倍信噪比的浓度（S/N=3），即为检测限（LOD）；约10倍信噪比的浓度（S/N=10）即为定量限（LOQ）。结果见表1。

表1 回归方程、相关系数、线性范围及检测限和定量限Tab.1 Regression equation， correlation coefficient， linear range， LOD and LOQ

由表5可知，没食子酸在4.48～179.2 μg/mL范围内线性关系良好，其检测限和定量限分别为7.2 ng/mL和23.9 ng/mL。儿茶素在4.14～165.6 μg/mL范围内线性关系良好，其检测限和定量限分别为82.8 ng/mL和310.5 ng/mL。绿原酸在8.42～505.2 μg/mL范围内线性关系良好，其检测限和定量限分别为12.6 ng/mL和42.1 ng/mL。

2.4.2 精密度考察

精密称取同一批拳参药材粉末，按“2.3”项下方法制备样品溶液，精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，进行不同日期，不同操作人员和不同色谱柱的精密度考察。测得没食子酸、儿茶素和绿原酸含量的RSD均小于3%，表明精密度良好。

2.4.3 重复性考察

精密称取同一批拳参药材粉末，按“2.3”项下方法分别制备高、中、低3个浓度水平的样品溶液，每个浓度平行3份。精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测得3个浓度水平下没食子酸、儿茶素和绿原酸含量的RSD均小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.4 加样回收试验

精密称取同一批已知含量的拳参药材粉末0.25 g，分为高、中、低3个水平，每个水平平行3份。分别按照拳参中没食子酸、儿茶素和绿原酸含量的50%、100%、150%加入对照品，按“2.3”项下方法平行制备9份供试品溶液。精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算3种成分的加样回收率及RSD值，结果见表2～4。

由表2～4可知，没食子酸、儿茶素和绿原酸的加样回收率范围均在85%～105%之间，其RSD值均≤3%，说明该方法加样回收率良好。

表2 没食子酸的回收率Tab.2 Recovery rate of gallic acid

表3 儿茶素的回收率Tab.3 Recovery rate of catechin

表4 绿原酸的回收率Tab.4 Recovery rate of chlorogenic acid

2.5 稳定性考察

取同一批拳参样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别于制备后 0 h，12 h，24 h和 48 h，按“2.1”项下色谱条件测定各成分含量，计算3个指标成分的含量，结果见表5。

表5 稳定性试验结果Tab.5 Results of stability test

由表5可知：48 h内拳参样品中没食子酸、儿茶素和绿原酸含量平均值分别为1.806 mg/g，1.990 mg/g和12.61 mg/g，RSD分别为0.54%，0.24%和0.39%，表明供试品溶液在48 h内稳定。

2.6 样品分析

取不同批次的拳参样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液5 μL，按“2.1”项下色谱条件测定各成分含量，计算3个指标成分的含量，测定6次，取平均值，结果见表6。

由表6可知：（1）3个成分中绿原酸含量最高，平均含量为7.16 mg/g，没食子酸和儿茶素较低，平均含量分别为0.98 mg/g和1.09 mg/g；（2）成分含量存在产地差异，来自甘肃的药材各成分含量明显高于其余产地。

表6 不同产地拳参含量测定结果Tab.6 Contents of gallic acid， catechin and chlorogenic acid in P. bistorta from different habitats （mg/g）

为进一步探讨产地对成分含量的影响，以没食子酸、儿茶素及绿原酸的含量及总含量为指标，将数据导入统计软件SIMCA 14.0（瑞典Umetrics公司）对18批次拳参的产地与含量进行主成分分析（Principal component analysis， PCA），结果见图2。图中每个点代表一个样本，以不同形状区分不同的产地。从图上作直观分析，可知同一产地的拳参样品能相对聚集，而不同产地的样品相对分离，表明成分含量存在显著产地差异。

图2 不同产地拳参主成分分析图Fig.2 Principal component analysis of P. bistorta from different habitats

3 讨论

本研究采用单因素分析方法对拳参样品的提取条件，例如提取溶剂（甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇），提取时间（20min、40 min、60 min、120 min），提取方式（超声提取、热回流提取、冷浸提取），提取溶剂体积（20 mL、50 mL、75 mL、100 mL），提取次数等进行了考察。最终确定样品制备条件为：精密称定0.5 g拳参粉末（过60目筛），置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 mL，称定重量，超声处理（功率：140 W，频率：100 kHz）40 min，冷却至室温后补足失重，摇匀，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

本研究对色谱条件进行了一系列优化。采用紫外全波长检测器对没食子酸、儿茶素和绿原酸进行全波长扫描，没食子酸的最大吸收波长为270 nm，儿茶素的最大吸收波长为278 nm，绿原酸的最大吸收波长是325 nm。结合3个成分的保留时间，使用可变波长检测器（Variable wavelength detector，VWD）将吸收波长定位 0～32 min为 270 nm，32～40 min为325 nm，以便能更准确地对3个成分进行同时检测。此外，对色谱柱、流动相、柱温、流速等参数进行了优化，最终确定色谱条件如下：流动相为0.04%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；洗脱梯度为0～5 min，0 → 1% B；5～10 min，1% → 5% B；10～40 min，5% → 8% B；流速为0.8 mL/min；柱温40 ℃；检测波长为270 nm（0～32 min）和325 nm（32～40min）。

含量测定结果显示，所测3个酚类成分之间含量差异较大，其中绿原酸含量最高，为1.269～15.601 mg/g。各成分之间含量差异也较大，18批样品中，没食子酸含量最大值为3.107 mg/g，可达最小值0.15 mg/g的20倍，儿茶素的含量最大值可达最小值的4倍，绿原酸的含量最大值可达最小值的12倍。不同产地拳参中成分含量差异大，可能与生长地理位置、生长环境、气温、土壤、光照、雨量、采收时期、加工运输等因素有关。

4 结论

2020年版《中国药典》［1］中拳参含量测定项规定含没食子酸不得少于0.12%，本研究中18批样品没食子酸含量为0.15～3.107 mg/g，均符合药典标准，表明该方法可作为综合评价拳参质量的参考。对3个指标成分及总量进行主成分分析，发现拳参中主要成分存在显著产地差异。