HS-SPME-GC-MS对百合中游离态和键合态挥发性成分分析

孙佳宁，连希希，孙伶俐，段正超，王联芝

（湖北民族大学 化学与环境工程学院，湖北 恩施 445000）

百合是百合属多年生药食两用植物［1］，主要种植在甘肃、江苏、湖南、浙江等省份［2］。百合鳞茎的药用历史悠久［3］，最早出现于《神农本草经》中［4］。传统上，国人常把百合作为镇静剂、抗炎剂、止咳剂以及一般的补药使用［5］。当前，百合多用于治疗失眠［6］、癌症［7］及肺部疾病等［8］。百合中的化学成分主要包含挥发油类、皂苷类、多糖类、多酚类等。挥发油作为一类重要组成成分，具有抗菌、抗炎、抗氧化等多种药理作用［9］，还可用于日化、保健、美容等领域。游离态的挥发性成分可以被人体直接感知，而键合态的挥发性成分因糖苷键的存在不易被人体感知，需要通过酸解或酶解释放出糖苷配基，才能实现增香而被人体感知［10］。近年来，关于新鲜百合中皂苷类、多糖类、多酚类等物质提取的报道逐渐增多，但对其挥发性成分的研究较少。其中，关于百合饮片挥发性成分的研究甚为少见，已有的报道多为对百合饮片游离态挥发性成分的检测，对键合态挥发性成分的研究极为罕见。

此外，挥发油广泛存在于中药材中，是芳香中药最具代表性的一类活性成分。我国中药材资源丰富且历史悠久，在预防和治疗慢性疾病等方面具有潜在的开发价值。因此，深入研究挥发油对于中药材的开发利用意义重大。

目前，挥发性成分的分析常采用气质联用、电子鼻、气相色谱-嗅闻等技术。顶空固相微萃取技术灵敏、快速、无污染［11］，克服了传统采样方法中成本偏高、耗时久和有机溶剂用量大等问题。然而，样品加热温度、体积、萃取时间和样品基质等实验参数，特别是固相微萃取纤维的选择性是影响实验结果的重要因素。因此，多数情况下使用组合吸附剂效果较好，如DVB/CAR/PDMS［12］。HS-SPME技术自推出以来，广泛应用于各个领域［13］，如：食品、香料、水体及环境污染物等的检测［14-16］。HS-SPME常与气相色谱-质谱联用，成为了一种近乎完美的现代分析方法［17］。朱文政等［18］采用该方法对红烧肉的挥发性成分进行分析，共测定出93种挥发性物质，醛类及酯类是其主要风味物质。刘金敏等［19］利用HS-SPME-GC-MS对姜科香辛料的挥发性风味物质进行了分析，检测出7类挥发性成分，萜烯类是姜科香辛料的特征风味物质。余远江等［20］分析了水产原料的挥发性风味成分，通过GC-MS鉴定出57种挥发性物质，主要成分为醇类及醛类。

为了能够更全面地了解百合中的挥发性成分，本实验采用水蒸气蒸馏法和煎煮法两种方法进行成分提取，并通过HS-SPME-GC-MS对两种方法提取的百合挥发性成分进行定性分析，采用内标法对各组分进行定量分析，以期为百合挥发性成分的进一步开发利用提供参考。

1 材料与仪器

1.1 样品与试剂

样品：百合（产地湖南邵阳），甘肃汉草品汇中药饮片有限公司。

正戊烷、乙酸乙酯、甲醇、氯化钠、柠檬酸、磷酸氢二钠、二氯甲烷、乙醚、仲辛酮（AR级，国药集团化学试剂有限公司）；Almonds β-D-葡萄糖苷酶（美国Sigma-Aldric公司）；Amberlite XAD-2树脂（20～60目，美国Supelco公司）；C7～C30正构烷烃（分析纯，美国 Sigma-Aldrich 公司）。

1.2 仪器与设备

6890N/5975MSD气质联用仪（美国Agilent公司）；CONCEPT多功能自动化样品前处理自动进样器（德国PAS公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取头（美国Supelco公司）；20 mL带隔垫（1.5 mm）顶空螺纹口样品瓶和A型磁力搅拌子；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）。

2 方法

2.1 游离态挥发性成分检测前处理

将百合粉碎，精确称取两份60 g样品分别置于500 mL烧瓶中。分别采用水蒸气蒸馏法和煎煮法提取12 h，分别收集提取液进行抽滤。各取滤液40 mL，加入8 μL仲辛酮（内标物）及8 g NaCl混和均匀，均分成四等份置于顶空螺纹口样品瓶中，进行三次平行实验以检测百合中游离态挥发性成分。

2.2 键合态挥发性成分检测前处理

称取50 g Amberlite XAD-2大孔吸附树脂，用纱布包裹后放入索氏提取器中加热回流。先后加入200 mL正戊烷、200 mL乙酸乙酯和200 mL甲醇，各回流12 h，甲醇中浸渍。以甲醇为溶剂，将预处理后的大孔吸附树脂进行湿法装柱（Φ32 mm×457 mm），去离子水冲洗至无味。为使样品与树脂充分键合，取2.1节中水蒸气蒸馏法提取后的滤液400 mL，以3 mL·min-1的流速流过该柱；采用600 mL去离子水冲洗色谱柱，除去水溶性糖和酸；采用600 mL乙醚-戊烷（1∶1，V/V）除去游离态挥发性成分；最后再用600 mL甲醇洗脱除去糖苷类物质。收集洗脱液并旋转蒸发浓缩至近干（水浴温度为35℃），少量多次将其溶于30 mL pH为 5.2的0.1 mol·L-1柠檬酸-0.2 mol·L-1Na2HPO4缓冲液中。用90 mL二氯甲烷-戊烷（1∶1，V/V）分三次萃取以除去可能残存的游离态挥发性成分；将Almonds β-D-葡萄糖苷酶600 mg加入萃取得到的水相中，放入恒温箱中（37℃）酶解48 h［21］；随后取40 mL酶解后的样品，加入8 μL仲辛酮及8 g NaCl混合均匀，将其均分成四等份放入顶空螺纹口样品瓶中，平行测定三次以检测百合中键合态挥发性成分。

2.3 HS-SPME-GC-MS分析挥发性成分

2.3.1 仪器条件

顶空固相微萃取条件：平衡时间和温度分别为30 min和50℃；老化时间5 min；萃取时间和温度分别为40 min和50℃；解析时间为1 min。

气相色谱条件：J&W DB-5MS毛细管色谱柱（30 m × 250 μm × 0.25 μm）；进样口温度250℃；程序升温（起始温度60℃，保持2 min；以8℃·min-1升温至220℃；保持20 min）；载气为氦气；流速1 mL·min-1；不分流进样；扫描方式为全扫描；调谐文件为标准调谐。

质谱条件：离子源温度230℃；离子化方式电子轰击（EI）；电子能量70 eV；质量范围45～550 u。

2.3.2 定性与定量分析方法

化合物的定性分析通过检索NIST08数据库，将测定的保留指数与相关文献报道的保留指数进行比对，参照标准质谱图确定。

以仲辛酮的乙醇溶液（0.9761 g·L-1）作为内标物，采用内标法对百合挥发性成分进行定量分析。根据仲辛酮的质量浓度及各成分与仲辛酮峰面积之间的比值，采用下式计算挥发性成分的含量。

式中：xi为成分含量，单位为μg·L-1；fi为待测成分（i）对内标物（S）的质量校正因子，令其为1；Ai为化合物的峰面积；As为内标物的峰面积；ms为内标化合物的质量浓度，单位为μg·L-1。

3 结果与分析

3.1 水蒸气蒸馏法提取百合挥发性成分分析

采用水蒸气蒸馏提取百合中的挥发性成分，并通过Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对糖苷类物质进行键合，利用Almonds β-D-葡萄糖苷酶对其进行酶解处理，并采用HS-SPME-GC-MS技术对百合挥发性成分进行检测，游离态和键合态挥发性成分的总离子流图如图1和图2所示。通过质谱定性分析和内标法定量分析，百合挥发性成分中游离态及键合态的HS-SPME-GC-MS 鉴定结果及各化合物的含量见表1和表2。

表1 百合（水蒸气蒸馏法）游离态挥发性化合物Tab.1 Free volatile compounds from lily （steam distillation）

表2 百合（水蒸气蒸馏法）键合态挥发性化合物Tab.2 Bonded volatile compounds from lily （steam distillation）

图1 百合（水蒸气蒸馏法）游离态香气成分的总离子流图Fig. 1 Total ion flow diagram of free aroma components in lily（steam distillation）

图2 百合（水蒸气蒸馏法）键合态香气成分的总离子流图Fig. 2 Total ion flow diagram of the bonded aroma components in lily （steam distillation）

采用水蒸气蒸馏法提取技术共检测出22种游离态成分，其中包括醛类、酮类、醇类、酯类、酚类及酸类，以酯类，醛类为主；7种键合态成分，包括酯类、酮类、醇类、酚类及呋喃类，以酯类为主。酚类和呋喃类化合物在百合中含量较低，酚类物质仅在游离态中检测出一种，呋喃类物质仅在键合态中检测出一种。

3.2 煎煮法提取百合挥发性成分分析

采用煎煮法提取百合中的挥发性成分，并采用HS-SPME-GC-MS技术进行检测，游离态挥发性成分的总离子流图如图3所示。通过质谱定性分析和内标法定量分析，HS-SPME-GC-MS鉴定结果及各化合物的含量见表3。

表3 百合（煎煮法）游离态挥发性化合物Tab.3 Free volatile compounds from lily （decoction method）

图3 百合（煎煮法）游离态香气成分的总离子流图Fig. 3 Total ion flow diagram of free aroma components in lily（decoction method）

采用煎煮法提取技术共检测出19种游离态成分，包括烷烃、烯烃、炔烃、醇类、醛类、酮类、酯类及酸酐共8类物质。其中检测出醇类化合物2种，烷烃类物质3种，是游离态中最主要的成分。酯类物质则含量很少。

3.3 不同提取方法所得的百合挥发性成分的对比分析

本实验采用GC-MS对水蒸气蒸馏和煎煮法提取百合中的挥发性成分进行分析，并对两种方法所提取的挥发性化合物进行对比。百合挥发性成分中不同类别成分的含量及相对含量见表4。

表4 各类物质的含量及相对含量Tab.4 The content and relative content of various substances

通过检测百合中游离态及键合态的挥发性成分，发现采用水蒸气蒸馏法提取共确定了26种化合物，包括酯类（5种）、醛类（9种）、醇类（4种）、酮类（3种）、酚类（2种）、酸类（2种）及呋喃类（1种）。其中游离态挥发性化合物22种，键合态挥发性化合物7种。采用煎煮法提取共确定了19种化合物，包括醇类（2种）、烷烃类（3种）、醛类（3种）、酸酐类（1种）、酮类（4种）、醚类（2种）、烯烃类（1种）、炔烃类（2种）及酯类（1种）。说明百合中游离态及键合态挥发性成分的检测采用HS-SPME-GC-MS方法可行。HS-SPME是一种不需要溶剂的萃取方法，结合GCMS分析百合中的挥发性成分有较好的效果。

从挥发性成分的分析结果来看，采用水蒸气蒸馏法提取的百合饮片中游离态和键合态成分中均含有倍半萜醇类物质柏木脑。柏木脑具有独特的香气，常被应用于香料、食品、化妆品、室内清香剂和消毒剂［22］，多项研究表明柏木脑还具有抑菌［23］、抗肿瘤［24］、抗焦虑［25］、抗炎及镇痛［26］等药理活性。很多酯类都具有果香气味，在检测到的挥发性成分中，有一定含量的邻苯二甲酸二丁酯及邻苯二甲酸二异丁酯，此类成分常被用作增塑剂，推测分析结果中的这类物质可能是环境或包装等方面的残留物［20］。正己醛是游离态中的一种主要成分，其主要由亚油酸氧化产生，呈清香的青草香味，其具有抗炎、镇痛的药理作用［27］。壬醛主要来源于油酸的氧化，呈清香、果香味等气味。而反式-2，4-癸二烯醛（11%）有青香、柑桔、脂肪等的香气。2，3-二氢苯并呋喃是键合态中的一种主要成分，其具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒及抗真菌等活性［28］，一直被药理学家及合成化学家重点研究。从中华卷柏中分离得到的具有许多药理活性的新木脂素类化合物同样含有2，3-二氢苯并呋喃，从米兰叶子中分离出的化合物也含有该成分，研究发现2，3-二氢苯并呋喃具有抗肿瘤活性［29］。

通过煎煮法提取的百合饮片游离态成分中，醇类是其最主要的成分，其可从脂氧合酶等途径产生［30］，正丙醇相对含量达50.58%，可应用于香料添加、日化用品、医药工业等方面；对甲基苯甲醛（10.66%）具有温柔的花香和杏仁香气味，可广泛应用于药物、精细化工等领域；烃类挥发性物质具有清香和甜香，正十七烷（6.03%）广泛应用于化妆品领域、异丁烷（5.35%）可用于催化等领域［31］。

通过水蒸气蒸馏法及煎煮法提取得到的百合挥发性成分数量相近，但在种类上有所差异。煎煮法主要提取出了烷烃类、烯烃类、炔烃类、酸酐类、醚类物质，而用水蒸气蒸馏法则没有提取出这些类物质，推测可能与样品的处理方式不同有关。水蒸气蒸馏法提取的温度较高，一些易挥发和热不稳定的成分可能会因此损失掉，提取种类较少；但水蒸气蒸馏法提取得到的挥发性成分药理活性较丰富，应用范围较广泛。分析百合挥发性成分时，煎煮法提取较简便，这两种方法各具优势，两者互补，亦可采用两种方式提取，以获得更全面完整的挥发性成分信息。

与新鲜百合花中挥发性化合物相比，百合饮片中挥发性化合物数量较少，二者在组成上有很大差异。孙春阳等［32］对新鲜百合花中的挥发油进行提取，共鉴定出37种化合物，主要成分为醇类、酮类、烷类、酯类等。张辉秀等［33］对不同品种的百合花挥发性成分进行分析，发现不同香型的百合花挥发性成分存在较大差异，其中β-罗勒烯和芳樟醇为浓香型百合花致香的关键成分。与本实验中百合饮片挥发性成分相比，化合物的类别基本相同，但新鲜百合花的挥发性成分更多，推测是因为某些沸点较低、易挥发的物质在由新鲜百合到百合饮片的加工过程中极易损失。

4 结论

通过对水蒸气蒸馏法及煎煮法提取百合中挥发性成分的比较分析，发现两种方法提取得到的百合挥发性成分有很大差异。因此在分析百合挥发性成分时，可以采用两种方法提取，将获得的GC-MS分析结果相结合，可以获得更全面具体的挥发性成分信息。本文首次对百合中的键合态挥发性成分进行研究报道，以期为百合进一步的开发利用提供实验依据，为改进百合饮片的制作工艺提供参考。