牙本质基质颗粒大小及脱矿条件对其性能的影响

陈华宇 许海辰 张 宇

(齐鲁医药学院，淄博 255000）

牙列缺损和牙列缺失是我国老年人主要口腔问题之一[1]，种植修复是目前最理想的修复方式，为满足种植术对牙槽骨骨量的要求，可在拔牙位点植入骨替代材料以恢复牙槽嵴高度。天然牙经去除牙釉质及软组织，对剩余牙本质进行脱矿处理，消除部分矿物成分以及免疫原性物质，磨碎后得到脱矿牙本质基质材料，是一种同时具备骨诱导、骨传导、骨生成能力的材料，大量实验研究表明其具有良好的成骨性能[2]，但对于其制备过程中不同脱矿方法和脱矿程度及颗粒大小对其性能影响的相关研究尚少。家兔与人的牙成分具有相似性[3]，由于兔牙易于获取，故本实验采用兔牙代替人牙进行初步实验探究，为牙本质基质材料后续研究和临床应用提供数据支持。

1 材料和方法

1.1 主要器材和材料

常规手术器械（手术刀、艾丽丝钳、拔牙钳等）；OCA 25 静态接触角测量仪（德国奥德利诺公司）；扫描电镜（日立SU8020）；傅里叶变换红外光谱仪（岛津IRTracer-100）；ELS5000 电子能谱仪（美国LK）；研磨器（安萨ALA）；生理盐水；HCL溶液；蒸馏水；新西兰家兔。

1.2 脱矿牙本质基质材料制备

将经过预处理（去除表面软组织，拔除牙髓，以口腔科高速手机磨除牙釉质）的新西兰家兔上颌门牙30 颗随机分为A/B 两组，每组15 颗；A组恒温20 ℃环境下置于盛有100 ml HCL 溶液（浓度1 mol/L）的广口瓶中脱矿45 min，经生理盐水反复冲洗后置于阴凉通风处自然风干24 h，用骨粉研磨器粉碎牙齿，选择不同孔径分样筛反复筛样4-5 次，制得3 种不同粒径（400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm） 的DDM 颗粒。B 组平均分成3 份，恒温20℃环境下分别置于盛有100 mL 不同浓度（1 mol/L、0.5 mol/L、0.25 mol/L）HCL 溶液的广口瓶中脱矿45 min，经生理盐水反复冲洗后置于阴凉通风处自然风干24 h，骨粉研磨器粉碎牙齿，选择粒径400 μm 分样筛反复筛样4-5 次，制得粒径400 μm 以下的自体牙本质颗粒。

1.3 DDM 颗粒表面扫描电镜观察

将A 组3 种不同粒径的DDM 颗粒分别进行超声清洗；使用2%戊二醛固定；50%、60%、70%、80%、90%、100%乙醇梯度脱水(无水乙醇脱水两次)，每次10 min;临界点干燥；喷金；扫描电镜（SEM）进行微观形貌观察，分析比较其差异。

1.4 DDM 颗粒静态接触角检测

分别将2 μL 去离子水滴在A 组3 种不同粒径的DDM 颗粒表面，等待3 s 至液滴稳定后进行静态接触角检测（测试环境：温度24.8℃；湿度68%），比较其亲水性差异。

1.5 DDM 颗粒衰减全反射红外光谱检测

将B 组采用3 种不同浓度HCL 溶液脱矿制得的DDM 颗粒分别置于红外光谱仪上，以4cm-1分辨率进行衰减全反射红外光谱检测，扫描波长399-4000 cm-1，采样32 次，采用OMNIC 7 软件去除水谱，矫正基线，分析其成分差异。

1.6 DDM 颗粒钙元素测定

对B 组采用3 种不同浓度HCL 溶液脱矿制得的DDM 颗粒分别用电子能谱仪进行钙元素分布（wt%）测定，为保证实验一致性，取每组样本颗粒横断面边缘点进行测试，每组重复3 次，取其平均值，观察各组钙含量变化情况。

1.7 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行单因素方差分析、t检验，P＜0.05 为差异具有显著性。

2 结果

2.1 扫描电镜观察结果

SEM 观察A 组3 种不同粒径牙本质颗粒，随机扫描结果显示：粒径400 μm 以下的DDM 颗粒呈破碎片状，牙本质小管暴露充分，间隙较多且形态不规则（图1A）；粒径400-800 μm 的DDM颗粒断面粗糙，可见牙本质小管，间隙较少，颗粒形态较为规整（图1B）；粒径800-1200 μm 的DDM 颗粒表面光滑连续，仅有少量破碎间隙存在于颗粒表面（图1C）。

图1 扫描电镜结果（×1000）

2.2 静态接触角检测结果

对A 组3 种不同粒径的DDM 颗粒进行静态接触角检测以评价其亲水性，结果显示粒径400 μm 以下、400-800 μm、800-1200 μm 的DDM颗粒静态接触角分别为6.0°（图2A）、67.0°（图2B）和96.7°（图2C），提示DDM 颗粒的亲水性随粒径减小而增强（P＜0.05）。结果提示：粒径400 μm 以下的DDM 颗粒植入患者创口后有利于血液的铺展润湿，为血液机化成骨提供前期保障。

图2 静态接触角检测结果

2.3 衰减全反射红外光谱检测结果

采用不同浓度HCL 脱矿制得的B 组3 种DDM颗粒的红外光谱图显示：所有DDM 颗粒均存在（1020±20） cm-1及566 cm-1两个强烈的吸收峰，分别为P-o 伸缩振动峰及P-o 变形振动峰，表明样品含有大量PO42-阴离子基团，与羟基磷灰石的红外光谱相符，其吸收度随脱矿所采用的HCL 浓度增加而呈现梯度式下降（P＜0.05），表明随着HCL浓度增加，DDM 颗粒中羟基磷灰石的含量降低。此外，3 种DDM 颗粒在3300cm-1附近均出现一个强烈而宽泛的吸收峰，对应胶原中的＞NH 和-OH，可见其吸收度差异不大（P＞0.05），提示在一定范围内采用不同浓度HCL 脱矿对DDM 颗粒中胶原的含量影响较小（图3）。

图3 不同浓度的HCL 脱矿制得的DDM 颗粒其红外光谱图检测结果

2.4 电子能谱仪测定钙元素分布结果

对B 组的3 种牙本质颗粒分别进行钙元素质量分布（wt%）测定，结果显示：在一定范围内随着脱矿程度增加，样品钙含量呈现梯度式降低，组间差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 B 组DDM 颗粒钙元素分布测定（wt%）

3 讨论

造成中老年人牙列缺损和牙列缺失的原因众多，牙齿缺失后破骨细胞活性增强、咀嚼物理刺激的缺失、血液供应的减少乃至中断等因素造成了牙槽骨的吸收[4]，骨量不足对种植修复造成了相当程度的困难。临床上可通过植入牙本质基质骨替代材料以达到种植术区骨增量的目的，牙本质基质各组分决定了其同时具备骨诱导、骨传导和骨生成能力。其中，羟基磷灰石具有与人骨相似的钙磷比以及天然孔隙结构，能将游离的磷酸盐与钙附着于骨[5]，此外，羟基磷灰石能诱导间充质干细胞向成骨细胞分化，具备良好的骨诱导活性[6]。Ⅰ型胶原能够为新骨生成与细胞附着提供载体，可与羟基磷灰石晶体一同构成支架，以促进成骨细胞的迁移。除此之外，牙本质中还含有骨形态发生蛋白（BMPs）、转化生长因子-β（TGF-β）、成纤维细胞生长因子（FGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）、表皮生长因子（EGF）以及胰岛素生长因子（IGF）[2]。为提升牙本质基质材料的成骨性能，通常会对其进行煅烧、冷冻、煮沸、脱矿和化学处理等[7]。目前关于脱矿牙本质颗粒材料的相关研究众多，但其材料制备方法并不统一，关于脱矿处理程度以及颗粒粒径对脱矿牙本质颗粒性能的影响并无定论，国内外相关研究尚少，鉴于此，设计了本次研究。

SEM 观察不同粒径DDM 颗粒的表面结构，结果显示：粒径400 μm 以下的DDM 颗粒呈破碎片状，其牙本质小管在本实验制备的3 种不同粒径颗粒中暴露最充分，间隙较多且形态不规则，此种结构可提供更多的蛋白质释放通道，利于牙本质中所含有的诱导成骨活性成分释放[8]。此外，粒径越小的牙本质颗粒其空隙率越大，具备更大的比表面积，利于肉芽组织的长入完成机化过程，加速单骨的形成，也利于牙本质颗粒在植入位点降解及新骨的长入，具备更好的骨传导性能[9]。良好的亲水性使得体液在植入材料表面扩散，促进其周围细胞内环境形成，更利于成骨细胞黏附以及增殖分化，对于牙本质颗粒的生物相容性至关重要[10]。本研究通过测量不同粒径脱矿牙本质颗粒的静态接触角以评价其亲水性差异，结果显示：牙本质颗粒随粒径减小，亲水性逐渐增强，在粒径400 μm 以下的牙本质颗粒中静态液滴几乎完全铺展开，其静态接触角＜6°，展现出优异的亲水性。根据以上实验结果，在一定范围内粒径越小的DDM 颗粒或许具备更优的成骨性能和生物相容性。

现有研究显示，羟基磷灰石晶体会阻碍牙本质材料中生长因子的释放，导致其骨诱导性能降低或延迟表达，脱矿处理可去除部分羟基磷灰石晶体并加大牙本质小管的管径，利于生长因子释放，提升成骨性能，并消除免疫原性[11-12]。过度脱矿导致羟基磷灰石晶体过少也会导致材料的机械性能下降，不利于持续稳定的成骨[13-14]。因此在对牙本质进行脱矿处理时，为达到材料的最佳成骨性能，脱矿程度的控制显得尤为重要。衰减全反射红外光谱检测3 种不同脱矿程度的牙本质基质材料，结果显示其特征峰与标准羟基磷灰石特征峰以及胶原特征峰基本相符，表明其主要成分为羟基磷灰石以及胶原。在一定范围内随着脱矿程度的增加，羟基磷灰石的特征峰吸收度越来越低，而胶原的特征吸收峰变化较小，表明在一定范围内随着脱矿程度的增加，脱矿牙本质颗粒内羟基磷灰石的含量越来越低，而胶原成分所受影响较小。钙元素测定实验也同样支持这一结果。

脱矿牙本质基质材料成骨性能的影响因素是多方面的，脱矿处理利于生长因子释放的同时也会破坏骨诱导活性成分，两者存在此消彼长的矛盾，对于何种脱矿程度能更利于生长因子释放的同时尽可能少的影响其骨诱导活性，尚无定论。此外，本研究仅限于对脱矿自体牙本质颗粒性能的实验室检测，其生物体内的成骨性能以及远期效果尚需进一步的实验研究。

4 结论

本研究结果表明：粒径较小的DDM 材料牙本质小管暴露更充分，且具有更优的亲水性，脱矿程度的增加会降低DDM 材料中无机物的含量，但对胶原含量影响较小。