静电纺胶原蛋白纳米纤维的研究进展

韩洪帅 宋秘钊 王彦珍 李家鑫

（1.齐齐哈尔大学，黑龙江齐齐哈尔，161006；2.寒区麻及制品教育部工程研究中心，黑龙江齐齐哈尔，161006）

纳米纤维因具备尺寸效应和表/界面效应而广泛应用于生物医用、食品包装、吸附过滤、传感等领域［1-2］，采用静电纺丝法制备具有成本低廉、生产设备简单、工艺可控等优点［3］。随着技术的发展，静电纺丝用原料趋向多元化，如天然高聚物（纤维素、蛋白质、多糖等）和合成高聚物（聚乙烯醇、聚己内酯、聚乳酸等）。其中胶原（Col）作为蛋白质的一种，是天然的生物大分子材料，而且具有良好的生物相容性、低免疫原性、可降解性、可吸收性，在止血、伤口愈合、药物缓释载体和组织工程等方面有广泛应用。静电纺胶原蛋白纳米纤维比表面积大，孔隙率高，具有良好的生物相容性，含有大量的活性基团、模拟细胞外基质，兼具纳米纤维的结构特征和胶原蛋白的化学特征，是理想的生物医用材料，具有良好的发展前景。应用于生物组织工程中的静电纺纳米纤维要具备安全性好和毒性低等特点［4］。胶原蛋白在受到青睐的同时也存在一些问题，比如异种胶原蛋白引起的细胞免疫反应，残存溶剂以及交联剂的毒性问题尚未完全解决，胶原蛋白纳米纤维材料的应用还处于初级阶段［5］，尚未有临床应用的报道。本研究对静电纺胶原蛋白纳米纤维的改性方法及其在生物医用领域的应用技术进展、相关问题作以总结分析，旨在为该方面的技术研究工作提供参考。

1 静电纺丝用胶原蛋白的来源

胶原蛋白材料来源丰富，广泛存在于动物组织中，如肌腱、骨骼、皮肤、鱼鳞、内脏等，而胶原蛋白的提取方法也较多，有酶法、酸法、盐法、碱法、热水法等［6-7］。其中盐法是利用不同类型的胶原蛋白溶于不同浓度的盐，常用于胶原蛋白的分离纯化；热水法是高温破坏胶原蛋白中的共价键和氢键，导致胶原蛋白变性，常用于明胶的制备。通常使用两种或两种以上方法提取胶原蛋白，如酸酶复合提取法，不仅效率高，而且效果好。

1.1 肌腱

牟玉洁［8］利用酸酶复合提取法从牛跟腱中提取胶原，用六氟异丙醇溶解胶原后采用静电纺方法制备纳米纤维膜，经生物学评价，材料的细胞毒性为0级，SEM 结果显示细胞能在膜上黏附伸展，并表现出增殖特征，表明制备的纺丝膜具有良好的细胞相容性和生物学特性，同时检测发现纤维膜与动物血液具有良好的相容性，符合国家生物医药制品标准。赵林双［9］以牛肌腱胶原为材料，聚氧化乙烯（PEO）为助纺剂，HFIP和乙酸（1∶1）混合溶液为溶剂，静电纺制备出不同浓度的胶原/PEO膜，测得牛肌腱胶原基纳米纤维膜具有纳米级纤维结构，能够模拟人体细胞间质的结构特征，具有较高的细胞相容性。

1.2 骨组织

甘文梅等［10］用酸酶复合提取法从牛骨中提取胶原蛋白，经戊烷/己烷进行脱脂、乙二胺四乙酸脱钙处理后，采用醋酸和胃蛋白酶提取牛骨胶原蛋白，利用响应面法优化了提取工艺，发现牛骨中含有丰富的I型胶原蛋白，可用于医疗领域。HOU C L等［11］利用羊骨提取胶原蛋白，将其与壳聚糖（CS）共混成膜，结果表明胶原蛋白与CS形成分子间氢键和静电作用，提高了膜的拉伸强度，而且添加CS后，复合膜更加光滑、坚韧、透明，两者共混具有良好的抗菌性、成膜性和力学性能。从动物骨中提取胶原蛋白工艺复杂，胶原提取率和纯度都较低，利用骨胶原蛋白进行静电纺丝的研究较少，需要加大对静电纺骨胶原蛋白纳米纤维膜制备与改性的研究。

1.3 动物皮

王彦珍等［12］利用羊皮作为原材料，用盐酸提取羊皮胶原蛋白，用甲酸/乙酸混合液作为溶剂，利用静电纺成功制备羊皮胶原蛋白/聚乙烯醇复合纳米纤维膜，其吸水性高，成纤性好，热稳定性较高。DONG B等［13］以牛皮中的胶原蛋白为材料，以六氟异丙醇作为溶剂、磷酸盐缓冲溶液为良溶剂，制备胶原蛋白纳米纤维支架，红外光谱表明静电纺丝后胶原蛋白的三重螺旋结构得以保留。

虽然从牛、羊等哺乳动物体内提取胶原工艺简单，胶原含量多，但是哺乳动物具有感染和传播流行性疾病的风险，因此鱼类胶原蛋白被认为是一种哺乳动物胶原蛋白的替代品。王佳冕［14］利用酸酶复合提取法从林蛙皮中提取胶原蛋白，以六氟异丙醇作溶剂静电纺制备胶原纳米纤维膜，经细胞学评价，其符合人成纤维细胞的生长特性，且对细胞增殖有一定的促进作用，有助于创口愈合。LI D S等［15］以罗非鱼皮胶原为材料制备了静电纺胶原蛋白纳米纤维膜，研究得出提取的胶原为I型胶原蛋白，胶原纳米纤维材料具有良好的生物相容性和低免疫原性。

1.4 人工合成胶原蛋白

从动物组织中提取的胶原蛋白应用广泛，但其难以修饰，并且存在着细胞免疫的潜在风险，人工重组合成胶原蛋白成为一种新的途径［16］。类人胶原蛋白是人工重组合成胶原蛋白的典型代表，已成功制备［17］。类人胶原蛋白是将人体胶原蛋白的信使核糖核酸逆转录成互补脱氧核糖核酸，经酶切后的一段基因重组于大肠杆菌内，经过高密度发酵、分离、复性、纯化工艺生产的一种高分子生物蛋白［18］。类人胶原蛋白无毒无刺激，零风险，可用于组织工程等医用领域。此外，还有人工化学合成胶原蛋白，KUMAR V等［19］利用36个氨基酸残基胶原，模拟多肽自组装设计胶原纳米纤维，研究发现自组装胶原纳米纤维具有三螺旋结构，具有良好的生物兼容性，可以黏附和激活血小板形成凝块，不引起感染，这种人工合成仿生胶原纤维具有促进愈合的作用，可用于止血。

2 静电纺胶原蛋白纳米纤维的改性方法

胶原具有优良的生物相容性，可降解可吸收，但天然胶原蛋白力学性能差、易降解、可纺性低，影响了胶原蛋白纳米纤维材料在生物医用领域的应用。为此，研究人员对胶原蛋白进行改性，以提高其力学性能、可纺性、热稳定性和弹性模量，常见的胶原蛋白改性方法有交联改性和共混改性［20］。

2.1 交联改性

交联改性是指通过共价键在胶原分子内和分子间结合实现提高胶原分子稳定性的方法。常采用戊二醛、碳二亚胺、京尼平等化学试剂对胶原蛋白进行化学交联改性［21］，常采用热处理法、紫外线法、脱水法等物理方法交联改性。

2.1.1 化学交联改性

戊二醛的醛基可与胶原分子的伯氨基形成席夫碱，交联后的纳米纤维膜拉伸强度、热稳定性、抗水解能力都有明显提高。石鑫［22］在仿去上皮羊膜的研究过程中，首先使用静电纺技术制得胶原基纳米纤维膜，再采用戊二醛对复合薄膜进行交联，发现交联提高了复合膜的透明度、弹性模量以及可操作性。但是醛类交联剂存在细胞毒性问题，作为胶原蛋白纳米医用纤维的改性交联剂使用存在安全隐患，因此有学者研究超临界二氧化碳萃取技术去除胶原蛋白残留的戊二醛或其他交联试剂，结果显示戊二醛浓度降低了95%以上，仅需1 h即可完成；此外CO2处理对胶原膜的热稳定性影响不大，却显著提高了薄膜的硬度和拉伸强度［23］。

碳二亚胺对胶原蛋白的交联是通过在醛基和氨基之间形成酰胺键完成的，而且碳二亚胺能够促进细胞的黏附增殖。赵新哲等［24］使用静电纺制备胶原基纳米纤维膜，通过碳二亚胺盐酸盐对其进行交联改性，结果表明纤维膜在液态环境下浸渍7 d后仍能保持良好的纳米纤维形态，纤维的溶胀率不高于180%；交联改性后的纤维膜拉伸强力增加50%，力学性能得以改善；溶血试验发现未对红细胞造成损伤，凝血指数降低至20%。

京尼平（GP） 可与胶原蛋白的游离氨基发生席夫碱反应，而且GP是栀子苷经β-葡萄糖苷酶水解后的产物，是一种优良的天然交联剂，其毒性远低于戊二醛等化学交联剂。LUO X S等［25］采用京尼平（GP）、N-（3-二甲氨基丙基）-N′-乙基碳化二亚胺盐酸盐/N-羟基磺基丁二酰亚胺（EDC/NHS）和戊二醛（GTA）作为交联剂静电纺胶原纤维，发现3种交联剂都可以有效地维持纳米纤维形态，改善了干、湿两种状态下的力学性能，尤其是EDC/NHS交联改性后具有较大的极限拉伸应力；在细胞评价中，3种改性纤维支持小鼠胚胎成骨细胞的黏附、扩散和增殖，但GTA交联改性纤维的细胞活力相对较低，而GP交联改性纤维的细胞相容性更高。可以选取京尼平以及碳二亚胺盐酸盐类交联剂改性胶原蛋白纳米纤维膜。

2.1.2 物理交联改性

物理交联改性胶原蛋白的方法相比于化学交联方法无毒无污染，不过交联效果弱一些。赵林双选取牛肌腱胶原静电纺丝膜进行热交联，研究表明热交联后的牛肌腱胶原静电纺丝膜纤维直径变小，力学性能有较大程度的增强，但是水溶解性能并未有效改善。董鹏飞［26］采用静电纺丝法制备胶原基纳米纤维进行药物可控性释放研究，对胶原纳米纤维进行紫外线交联改性，经测试紫外交联没有破坏纤维的形貌，并且提高了膜的耐水性和拉伸强力，改性胶原纳米纤维吸水率较低，比纯胶原纤维降低了11.78%，拉伸强度是原来的两倍。

2.2 共混改性

胶原蛋白纳米纤维作为生物医用材料对缺损组织的修复、再生及重建有着重要作用，需求量巨大，单独纺胶原蛋白纳米医用纤维已经满足不了应用需求，因此开始了共混纺丝研究，即依据应用需求选择合适的材料与胶原混纺以期满足使用要求，而且相较于化学交联剂，物理共混安全无毒，复合纳米纤维材料性能优良。

2.2.1 胶原蛋白与天然高聚物共混纺丝

崔新爱［27］采用静电纺丝法制备胶原蛋白和丝素蛋白复合纳米纤维支架，发现最佳复合比为1∶1，而且丝素蛋白的加入明显改善了胶原纳米纤维的强度和韧性，复合膜的平均断裂强度为7.32 MPa，平均断裂延伸率为3.98%。SIONKOWSKA A等［28］将鼠尾肌腱胶原与壳聚糖共混进行静电纺丝，发现在成膜过程中胶原蛋白的羟基、氨基、羧基能与壳聚糖的氨基和羧基形成分子间氢键相互作用，而且壳聚糖的氨基在酸性环境下容易被质子化形成氨基正离子并与呈阴离子性的胶原形成静电作用，力学性能得到显著提高，表明胶原和壳聚糖是可混溶的，在分子水平上相互作用形成新的氢键网络，从而改变了胶原的螺旋特性以及共混物的特性。JELENA R K等［29］选择80%弹性蛋白和20%胶原蛋白静电纺纳米纤维支架，发现胶原复合支架可以促进真皮成纤维细胞的增殖以及提高细胞迁移率，并且在小鼠皮下植入的耐受性良好，可持续6周以上，支架支持成纤细胞浸润、新生胶原沉积和新的毛细血管形成，有望成为理想的真皮替代物。

2.2.2 胶原蛋白与合成高聚物共混纺丝

林童［30］采用静电纺制备林蛙皮胶原蛋白和左旋聚乳酸（PLLA）复合纳米纤维膜，发现随着PLLA的增加，复合纳米纤维的弹性模量增大，表面张力增加，硬度随之降低，研究得出复合膜能满足人体特殊部位对创伤敷料的需求。MIOARA D等［31］用静电纺制备聚对苯二甲酸乙酯/胶原蛋白复合纳米纤维，研究发现，与纯胶原蛋白纳米纤维相比，复合纳米纤维的力学性能和弹性模量显著提升，且不具有细胞毒性。LIN H Y等［32］将聚乙烯醇（PVA）与胶原蛋白复合后静电纺制备纳米纤维膜，发现PVA的加入显著提高了纳米纤维的断裂伸长率以及断裂强度，体外生物相容性更好，胶原纤维与聚乙烯醇纤维纵横交错形成更加稳固的纤维网结构。

随着生活水平的提高，消费结构呈现多元化和个性化，医用胶原产品的市场需求呈现快速增长的趋势。为了进一步提高胶原纳米纤维的性能，学者开始将共混纺丝与交联改性相结合，选择合适的共混材料以及交联方法成为研究重点。赵新哲［33］采用天然抗菌剂壳聚糖（CS）、聚环氧乙烷（PEO）和胶原（Col）三者共混静电纺Col/CS/PEO纳米纤维膜，既满足止血、透气、保湿功能，又能阻止细菌感染、促进伤口愈合和防止敷料黏连，然后又将Col/CS/PEO复合纳米纤维膜用EDC/NHS交联剂交联改性，经过测试得出纳米纤维膜在液态环境下结构稳定，拉伸性能、凝血性能及细胞增殖性能显著提升。

3 静电纺胶原蛋白纳米纤维的应用前景

在国内，一些胶原类生物材料已获国家食品、药品监督管理机构的批准，并应用于食品、药品、美容、止血材料等领域，在国外该类产品也获认证与批准。但胶原基纳米纤维材料起步晚，缺少临床试验，在生物医用纤维中应用较少。静电纺胶原纳米纤维比表面积大，孔隙率高，可降解，可吸收，含有活性基团，在止血材料、药物缓释载体、生物组织工程支架等领域具有应用前景。

3.1 止血材料

3.1.1 医用缝合线

KARINA D S等［34］将 聚 乳 酸-羟 基 乙 酸（PLGA）和牛骨胶原蛋白复合，利用尖端诱导共轭效应静电纺纳米纤维纱线，并添加麻疯树叶提取物增加其抗菌性，试验显示所有样品的活细胞百分率均在50%以上，抑菌带在5 mm～10 mm；最佳样品在浸泡60 d的降解率为82.2%。可见PLGA/Col/麻疯树提取物复合纱线安全无毒，有抗菌止血功能，可作为可吸收外科手术缝合线。

3.1.2 创伤敷料

尚柯［35］采取添加银离子静电纺制备胶原基纳米纤维，发现结合有抗菌剂的胶原纤维敷料不仅止血时间短，而且对几种代表性的致病菌都具有良好的抗菌效果。JEONG I K等［36］用静电纺制备胶原蛋白/聚己内酯（PCL）复合纳米纤维膜，发现具备高孔隙率和纳米拓扑结构的胶原蛋白/PCL纳米纤维膜适于细胞的黏附、生长、繁殖，大鼠体内开放性伤口愈合试验显示纳米纤维胶原蛋白覆盖创面愈合效果与纱布覆盖创面相似，而胶原蛋白组早期愈合速度更快。

3.2 药物缓释载体

SUNDAR S S等［37］采用静电纺制备胶原蛋白/聚丙烯酰胺/壳聚糖与抗癌药物5-氟尿嘧啶复合物，壳聚糖浓度的增加延缓了药物从纤维网络的释放，聚丙烯酰胺的加入提高了模型的血液相容性，该复合材料在肿瘤治疗领域具有巨大价值，可作为肿瘤手术后治疗的药物传递剂和血液接触生物材料。国内学者也研究发现，胶原作为5-氟尿嘧啶药物的载药基体，药物突释现象明显减少，增加了药物的利用率，有效降低了副作用［38］。郭慧文等［39］以胶原和聚氧化乙烯为核层材料，壳聚糖和聚氧化乙烯为壳层材料，采用同轴静电纺技术成功制备出核-壳结构纳米纤维，并将质量分数为5%的盐酸环丙沙星负载到核层以提供抗菌性能，通过药物体外释放试验发现，核-壳纳米纤维膜负载药物释放缓慢，24 h才释放约25%，为负载药物提供新的方法与思路。

3.3 生物组织工程支架

支架最早出现于20世纪后期，先后经历了第一代的金属支架、第二代的药物涂层支架和最新的生物可吸收支架等不同的历程，现在应用最广泛的是第二代药物涂层支架。而胶原纳米纤维支架可降解可吸收，具有模拟细胞外基质的功能，有良好的生物相容性以及低免疫原性，使细胞能够黏附在生物材料上进行扩增，从而达到修复组织的目的，同时三维纤维支架中多孔网状结构提高了支架的稳定性和细胞相容性［40］。

3.3.1 骨支架

骨组织的主要成分是胶原蛋白、磷酸钙和成骨细胞，当骨组织缺损或病变时需要替换骨组织，其中自体骨移植供给有限且会造成二次伤害，异体骨有感染疾病风险及免疫排斥等问题，因此利用胶原蛋白合成人工骨受到广泛应用。目前临床试验上利用静电纺丝法制备胶原类骨支架具有更好的生物相容性及降解性，诱导成骨细胞的生长和自体骨的合成。EKAPUTRA A K等［41］成功将猪骨髓间充质干细胞（pBMMCs）包裹在聚ε-己内酯（PCL）和胶原纳米复合支架上，可以在纤维网上黏附和增殖，发现在动态条件下培养这些结构体可增强骨样组织形成和机械强度。王思青等［42］用静电纺丝法制备胶原/PCL/纳米锆酸钙（n CZ） 和胶原/PCL/纳米羟基磷灰石（n HA）复合支架，与人牙周膜细胞（PDLCs）共培养，发现前者复合支架具有更加优良的力学性能和生物相容性，具备成骨诱导的潜力，而且可以被组织吸收，减少炎症反应。

3.3.2 心脏瓣膜支架

心脏支架要安全无毒，无免疫反应，同时具备一定的力学性能。陈锐［43］利用聚氨酯和胶原蛋白静电纺复合纳米纤维，从结构和功能上仿生天然心脏瓣膜组织细胞外基质，在改变培养液流速和培养时间的情况下，细胞在支架上的黏附繁殖能力较好，结果表明静电纺支架可以为细胞提供一个良好的生长空间，外部剪切应力不影响细胞正常生长。MARIA K等［44］采用静电纺胶原纳米纤作为心脏补片，心肌细胞在纤维支架上呈现三维生长态势，用扩张型心肌病小鼠进行试验，发现支架的生物相容性良好，植入两周后未见明显炎症，抗原性较低。

3.3.3 血管支架

血管移植工程是再生医学的一个新兴领域，JIA W B等［45］制备胶原-透明质酸寡糖（Col- HA）纳米纤维支架，试验表明，支架能够促进猪髂动脉内皮细胞增殖，具有促进血管内皮分化潜能，是血管组织工程内层支架的较好选择。IFFA A F等［46］将PLLA、CS和胶原蛋白共混，静电纺制备血管工程导管，发现导管抗张强度大、爆破压均在原生血管的数值范围内，符合血管移植材料高血液相容性和低细胞毒性的要求。

3.3.4 角膜支架

WU Z J等［47］将聚醋酸乙烯酯（PVAc）和胶原蛋白复合静电纺丝，以增强胶原蛋白静电纺丝支架的机械强度，发现人角质细胞和人角膜上皮细胞黏附和增殖良好，定向纳米纤维诱导人角质细胞有序生长，适用于组织工程角膜。

静电纺胶原基纳米纤维在生物组织工程支架中表现出良好的应用潜力，试验表明细胞可以在支架上黏附、增值，而选取合适的胶原基纳米纤维支架和生物细胞发挥协同作用尤为重要。但是研究多为体外试验，后期纤维支架试验还需进一步优化。

4 结语

随着科技的发展，选用鱼类胶原蛋白以及类人胶原蛋白可以降低乃至避免异种胶原蛋白的传染性疾病以及免疫原性，更适合胶原蛋白纳米纤维在生物医用领域的应用。静电纺胶原蛋白的溶剂可以选择类似乙醇/磷酸盐缓冲溶液的中性盐溶液，减少对胶原的破坏以及毒性问题。在胶原改性方面，利用胶原蛋白与有机高分子静电纺丝制备复合纳米纤维膜，既结合了胶原的生物相容性、可降解性、低免疫原性，又结合了有机高分子优异的力学性能、成膜性，同时选用低毒无毒的交联改性方法（京尼平、碳二亚胺盐酸盐）提高膜的物理性能，可仿天然细胞外基质，在止血、药物载释、骨再生、真皮替代物等生物医疗领域具有发展潜力。目前国内外利用静电纺丝技术制备胶原蛋白纳米纤维还处于实验室阶段，工艺参数以及纺丝设备还不成熟，工业化制备较少，胶原纳米纤维材料的临床试验与临床应用缺乏。需要继续改进静电纺丝工艺，深入研究胶原基纳米纤维的结构调控，重点研究胶原纳米纤维的临床试验与临床应用，以满足生物组织工程的需求。