激活蛋白-1在骨代谢相关信号通路中的作用研究进展

司艳凤，张媛媛，毕凌云

(新乡医学院第一附属医院儿科，河南 卫辉 453100)

代谢性骨疾病是指机体因先天或后天因素破坏或干扰了正常骨代谢和生化状态，导致骨生化代谢障碍而发生的骨疾病，发病机制包括骨吸收、骨生长和矿物质沉积的异常[1]。成骨细胞和破骨细胞是维持骨骼生长及修复的重要细胞，健康成人成骨细胞的骨形成作用基本相当于破骨细胞的骨吸收作用，维持骨代谢平衡状态[2-3]。代谢性骨疾病主要表现为骨形成和骨吸收之间的转换紊乱或异常。激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)在骨骼生长和稳态中具有重要作用，与其调控破骨细胞和成骨细胞的增殖、分化和凋亡相关[4]。AP-1作为核因子-κB受体活化因子配体(receptor-activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL)/核因子-κB受体活化因子(receptor-activator of nuclear factor kappa B，RANK)信号通路的重要转录因子，其活性可受其他转录因子的调节及信号通路的上游激酶的控制[5-6]，其活化后可通过核因子-κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)和Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kinase，JNK)、细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和p38信号通路调节破骨细胞形成，参与骨代谢过程，与骨质疏松、骨肿瘤等代谢性骨病的发生发展相关[7]。鉴于AP-1生物学活性的多样性及其在代谢性骨疾病发病中的作用，AP-1及其调节因子有望成为代谢性骨疾病的治疗靶点。本文就AP-1的结构和生物活性及其在骨代谢相关信号通路中的作用研究进展作一综述，以期为代谢性骨疾病的治疗提供新的思路。

1 AP-1的结构和生物活性

1987年，AP-1被发现参与了对人金属硫蛋白(metallothionein，MT)Ⅱa基因和佛波酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13 acetate，TPA)诱导基因表达的调控，因而其被鉴定为转录因子，是目前已知的、最早的转录因子之一[8]。AP-1是由Fos、Jun、激活转录因子(activating transcription fator，ATF)及肌肉腱膜纤维肉瘤(musculoaponeurotic fibrosarcoma，MAF)蛋白家族组成的同源或异源二聚体[9]，如Fos/Jun、Jun/Jun、Fos/ATF等，但除外Fos/Fos[10]。这些蛋白质具有高度保守的碱性亮氨酸拉链结构域，其中亮氨酸拉链参与基因的二聚化，碱性区域可结合特定DNA基序[9]。目前，研究最多的是Jun和Fos蛋白家族，Fos家族成员包括c-Fos、FosB、FosB、Fra-l和Fra-2，Jun家族成员包括c-Jun、v-Jun、JunB和JunD，这些蛋白成员也是主要的AP-1组成蛋白。AP-1是调节细胞增殖、分化和凋亡的关键转录因子，在体内多种组织中都起着关键作用。AP-1作为基因转录的分子开关，其活性由细胞因子、生长因子、激素、氧化应激、紫外线照射、病毒和细菌感染等多种内在和外在的刺激和环境损伤所诱导[11]。活化的AP-1与TPA反应元件或cAMP反应元件中的DNA结合，进而调控染色质和基因转录，诱导基因组表达[8]。AP-1活性失调与肿瘤、哮喘及自身免疫性疾病等多种疾病的发生相关[7,12]，但早期关于AP-1的研究大多数集中在肿瘤生物学领域。

2 AP-1与骨代谢

骨代谢包括成骨细胞/软骨细胞参与骨形成，以及破骨细胞参与骨吸收，骨代谢的平衡状态对保持骨骼功能的完整性至关重要[4]。近年来，通过对携带不同Fos和Jun基因的小鼠和细胞的分析发现，AP-1 在骨发育和骨疾病中具有重要的生物学功能。

2.1 AP-1对成骨细胞/软骨细胞的调控作用AP-1参与成骨细胞分化的第1个实验证据来自于对过表达Fos转基因小鼠的分析，在这些小鼠中，c-Fos通过成骨细胞的转化促进成骨性肿瘤的形成，提示c-Fos 参与了体内的骨形成过程[13]。通过对Fos家族其他成员的研究发现，在成骨细胞中过表达Fra-1的转基因小鼠会随着整个骨骼形成的增强而形成骨硬化[11]；缺乏Fra-1的小鼠成骨细胞数量和正常破骨细胞没有改变，但骨基质生成减少。基于这些小鼠成骨细胞数量正常而骨基质成分减少，说明Fra-1在成骨细胞骨形成上的作用主要是通过调节基质的产生来影响成骨细胞活性，而不是通过影响成骨细胞的增殖或分化来影响成骨细胞活性。研究发现，胚胎和新生小鼠中缺乏Fra-2会影响软骨细胞的分化和基质的产生，小鼠在出生后不久会死于严重的骨质减少和其他器官缺陷[14]。由于成骨细胞的分化增加，Fra-2 过表达小鼠会发生骨硬化[15]，这可能与细胞的自主性有关。此外，缺乏JunB的小鼠，由于细胞自主性成骨细胞减少和破骨细胞增殖和分化的缺陷，也表现出骨质减少[16]。说明Fos和Jun蛋白是骨形成的关键调节剂，其作用机制可被用来开发治疗低骨质量疾病的新药。

2.2 AP-1对破骨细胞的调控作用Fos参与破骨细胞的形成来自于对c-Fos基因敲除小鼠动物模型的研究，研究发现，缺失c-Fos的小鼠由于缺乏破骨细胞，骨吸收减少导致骨量增加，进而发展成骨硬化[17]。Fra-1可以替代c-Fos在小鼠体内的功能，在Fra-1替代c-fos的转基因小鼠中，骨硬化表型可通过表达Fra-1得到缓解，并可以通过基因插入来实现完全恢复[18]。研究发现，当动物缺乏JunB时会导致破骨细胞的形成减少，说明JunB是破骨细胞分化过程中所需要的一个Jun成员[19]；然而，JunB缺乏并不会完全导致破骨细胞分化障碍，表明Jun成员可以在破骨细胞形成过程中部分地相互替代。

3 AP-1相关信号通路

RANK主要在破骨前体细胞和成熟破骨细胞中表达[20]，RANKL则主要在成骨细胞和骨细胞中表达[9]。当破骨前体细胞表面的RANK与成骨细胞释放的RANKL结合后，在肿瘤坏死因子受体相关因子(tumor necrosis factor receptor associated factor，TRAF)的参与下，刺激NF-κB和3种丝裂原激活蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)Jun氨基末端激酶(Jun N-terminal kina JNK)、ERK、p38通路启动下游级联信号传导[6,9]。MAPK属于丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶家族，可通过高度保守的三级激酶模式依次激活，即MAPK被MAPK激酶(mitogen-activated protein kinase kinase,MAPKK)磷酸化后激活，MAPKK被MAPKK激酸激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)磷酸化而激活。而MAPKKK通过与小GTPase和(或)其他蛋白酶相互作用而被激活，从而将MAPK和细胞表面的受体以及细胞外的信号联系在一起。

3.1 NF-κB信号通路活化T细胞核因子c1(nuclear factor of activated T-cell c1，NFATc1)是活化T细胞核因子的成员，是体内调节破骨细胞生成的重要调节因子[21]。RANKL与RANK结合后，TRAF6结合到RANKL的细胞质区，NF-κB抑制物激酶(inhibitor of NF-κB kinases，IKKs) 被激活，启动信号通路，激活NF-κB，活化的 NF-κB转移到细胞核内，NF-κB的p50和p65亚基因诱导c-fos、NFATc1 表达增加，c-fos与NFATc1 相互作用，引起破骨细胞基因的转录与表达，诱导破骨细胞生成[22]。基因芯片的全基因组分析也证实，RANKL在体外破骨细胞生成中可诱导NF-κB活化，启动信号通路[23]。研究发现，缺乏NF-κB亚基的小鼠由于成熟破骨细胞的缺乏而表现出严重的骨质疏松，体现了NF-κB信号通路在破骨细胞形成中的作用[22]。

3.2 JNK信号通路JNK由JNK1、JNK2和JNK3 3个基因编码，是MAPK的一个组成部分[24]。其中，JNK1和JNK2在多种组织中广泛表达，而JNK3主要在脑、睾丸和心脏组织中表达[25]。在RANKL-RANK-TRAF6-JNK信号通路中，活化的JNK通过磷酸化Fos、Jun 来增强 AP-1 的转录活性，促进破骨细胞形成[26]。DAVID等[27]、KE等[28]研究发现，RANKL可激活JNK1，并通过磷酸化c-Jun来调控破骨细胞生成。另有研究发现，通过使用SP600125(JNK抑制剂)阻断JNK和c-Jun通路，可抑制RANKL诱导的破骨细胞分化[29]，表明c-Jun激活对RANKL诱导破骨细胞分化十分必要。以上这些研究数据表明，JNK1和c-Jun的激活在RANKL诱导破骨细胞形成中必不可少。

3.3 ERK信号通路细胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)是MAPKs信号通路的另一重要成员，ERK主要以ERK1和ERK2形式存在。ERK1/2在细胞质中被激活(即磷酸化)，易位到细胞核，可激活转录因子c-Jun和Fos，进而调控AP-1的表达，促进破骨细胞分化[9]。胰岛素也可以通过ERK1/2激活诱导RANKL-RANK的表达，促进骨髓巨噬细胞向破骨细胞的分化。此外，人类分化的破骨细胞通过辅助性T细胞2(T-helper type 2 cell，Th2)受到前列腺素D2的攻击时发生凋亡，这也涉及到ERK1/2信号通路，但并不能作为IKKs/NF-κB信号通路的抑制[32]。因此，推测设计用来抑制ERK1/2激活的药物将被开发用于治疗那些通过ERK1/2激活导致基因表达失调的疾病。

3.4 p38MAPK 信号通路p38MAPK由p38MAPKα、p38MAPKβ、p38MAPKγ和 p38MAPKδ 4个家族成员组成，在调控细胞增殖、分化、组织发育及稳态中发挥重要作用[31]。RANKL与RANK结合后，在TRAF6的参与下，激活p38MAPK信号通路，激活后的p38MAPK通过磷酸化下游的信号分子肌细胞增强因子2C(myocyte enhancer factor 2C，MEF2C)及ATF-2，使AP-1复合物的表达增加，进而促进破骨前体细胞功能活化，分化生成破骨细胞[22]。此外，p38MAPK对成骨细胞也有重要的调节作用，有研究报道，在经典的Wnt3a刺激下，p38MAPK可提高β-catenin 转录活性，与经典的Wnt/β-catenin通路协同调控成骨细胞[32]。Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a和Wnt8是经典Wnt信号通路的主要细胞外蛋白。Wnt3a可通过抑制NF-κB诱导的NFATc1表达来抑制破骨细胞的形成。而在非经典Wnt信号通路中，Wnt4可通过参与转化生长因子-β活化激酶1(transforming growth factor beta activated kinase 1，TAK1)和NF-κB的激活，引起破骨细胞基因的表达，进而增加骨吸收[33-34]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMP)可激活成骨细胞中的p38MAPK，进而磷酸化Smad1，使其易位入核，协同Smad信号通路，调控骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[35]。因此，p38MAPK是调节骨代谢的重要信号通路，该通路中任何基因发生突变都有可能出现骨质疏松、骨肿瘤等代谢性骨疾病，研究调节成骨细胞及破骨细胞活性的药物将成为未来治疗代谢性骨疾病的新靶点。

3.5 其他信号通路RANK-RANKL信号通路除了通过NF-κB和JNK、ERK和p38信号通路调节破骨细胞形成外，蛋白激酶B及钙调磷酸酶-活化T细胞核因子信号通路[36]等也参与调节破骨细胞相关基因的表达，使骨吸收增强，引起骨质疏松。RANK-RANKL信号通路在成骨细胞中也具有重要的作用。研究表明，破骨细胞释放表达RANK的细胞外囊泡，与成骨细胞上的RANKL相互作用，可通过RANK-RANKL反向信号通路促进成骨细胞形成[37]；也可以通过上述p38MAPK介导的BMP信号通路、经典和非经典的Wnt信号通路调节成骨细胞的形成[38-39]。因此，RANKL-RANK信号通路是骨代谢性疾病的潜在治疗靶点。目前已研发出RANKL特异性人源性IgG2单克隆抗体德诺单抗(Denosumab)，用于治疗骨质疏松症、骨肉瘤[40]，但该药物长期应用的安全性还有待于进一步的研究。

4 结语与展望

AP-1作为RANKL/RANK信号通路的重要转录因子，主要通过NF-κB和JNK、ERK和p38信号通路调节破骨细胞形成，参与骨代谢过程，与骨质疏松、骨肿瘤等代谢性骨疾病的发生发展相关。目前，虽已研究出针对RANKL抑制骨吸收的人源性单克隆抗体德诺单抗用于治疗骨质疏松症、骨肉瘤，但该药物长期应用的安全性还有待于进一步研究。此外，在这些信号途径中，AP-1的活性受其他转录因子相互作用的调节及信号通路的上游激酶的控制，这为代谢性骨疾病的治疗提供了新的药物靶点，是未来研究的热点。