基因诊断技术在脊柱结核诊断中的应用现状

胡潮兴，梁秋冬

(1.新乡医学院第一附属医院，河南 卫辉 453100；2.新乡医学院第一附属医院脊柱与创伤外科二病区，河南 卫辉453100)

结核病的发病率与国家和地区的经济水平有关，低收入国家或地区结核病的发病率是高收入国家的10倍以上，病死率更是高出20倍以上。东南亚地区与西太平洋地区发展中国家的新发结核病病例数量占据了全球50%以上，结核病成为发展中国家面临的主要健康问题之一[1-2]。结核病患者常继发骨关节结核，而骨与关节结核中大约50%为脊柱结核，但从感染结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)到出现临床表现所需时间较长，一般需要 11.2 个月[3]。脊柱结核的起病及初期症状不典型，极易与化脓性脊柱炎、骨质疏松性椎体压缩骨折、各种脊柱原发肿瘤或转移瘤、嗜酸性肉芽肿等疾病相混淆，造成诊断失误[4]，增加患者痛苦、延误治疗。传统的诊断技术在诊断脊柱结核时存在一定的局限，基因诊断技术作为一种快速发展的新型诊断技术，在诊断脊柱结核中扮演着越来越重要的角色。本文将介绍临床中常见的几种基因诊断技术，以帮助临床工作者了解并灵活使用基因诊断技术，对于传统诊断技术难以诊断的脊柱结核进行早期、准确的判断，并使患者尽可能早期接受正规治疗，从而尽快改善患者的症状。

1 脊柱结核的流行现状

根据世界卫生组织(world health organization，WHO)报告，截至2017年，全世界范围内大约有17亿人口存在MTB潜伏感染，其中已有157万人因MTB感染死亡[1]。脊柱结核是一种最常见的肺外结核，其发病率居骨关节结核第1位。随着科技的不断进步、诊断工具的发展和外科手术术式的改良，脊柱结核的诊断以及治疗水平得以逐步提高，但受耐药菌群、人类免疫缺陷病毒流行趋势增加等各方面因素的影响，尤其是在经济不发达、卫生条件较差的地区，脊柱结核患病率呈上升趋势。MTB感染病灶多位于脊柱的椎体部分，且易侵及椎管，造成椎管内脓肿形成，对脊髓或神经产生压迫，使患者出现各种神经症状，甚至残留难以恢复的脊髓神经严重后遗症，对患者和社会造成严重的影响[5]。脊柱结核的诊断与肺结核不同，如结核杆菌纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)皮肤试验、血清抗结核抗体检测、涂片抗酸染色检查等传统的检查方法在肺结核病方面表现出良好诊断价值，但对脊柱结核的检出率明显偏低，导致脊柱结核误诊在临床上很常见[6]。

2 脊柱结核的发病机制及漏诊、误诊因素

脊柱结核主要由MTB从原发灶(如肺结核、肠结核、淋巴结核等)经血液循环播散侵入椎体引发。流行病学调查结果显示，脊柱结核最常累及的部位为腰椎[7]。与肺结核不同，脊柱结核患者因少有咳嗽、咳痰、低热、盗汗等典型结核毒性症状，早期常常较易漏诊或误诊。早期脊柱结核以局部症状为主，多为脊柱节段性僵硬和活动时疼痛等；由于幼儿缺乏主动表达的能力，常表现为 “夜啼” 现象。每个个体因其免疫能力强弱及感染菌种毒力不同，脊柱结核的发病情况差异也较大。对于营养条件良好、身体素质佳的患者，即使未经规范诊治，症状也能逐渐自行好转，甚至有的患者无明显的不适症状，或者仅有轻度不适而不知道患上脊柱结核[8]。但大多数患者在缺乏规范的抗结核药物治疗情况下，随着MTB对椎体造成的侵蚀逐渐加重，可出现脊柱稳定性降低、脊柱后凸畸形、椎旁冷脓肿或窦道形成等一系列症状，较严重者可因为脊髓压迫或炎症刺激而出现严重的神经损害症状(如截瘫、脊柱畸形、四肢无力等)，有些家庭往往因此丧失主要经济来源从而因病致贫。因为脊柱结核发病与肺结核相比更加隐匿，导致患者更加容易忽视不明显的不适症状，而基层医院诊疗水平的参差不齐又常导致误诊，从而延误最佳治疗时机。有的患者甚至疾病持续几个月到几年才来就诊，甚至有的患者因为出现脊柱后凸畸形与神经障碍症状才就诊[9]。由此可见，脊柱结核因为其早期症状不典型，常常被患者忽视，从而导致缺乏早期干预，就诊时已错过最佳的治疗时机，可导致患者丧失劳动力。脊柱结核如果得到及时规范的抗结核治疗，预后往往较好，因此，脊柱结核的早期准确诊断对患者的预后有很大影响。

3 脊柱结核的诊断标准

结核病诊断的金标准为MTB培养。但在肺外结核诊治领域，国内仍缺乏权威性的指南或诊疗规范。在临床中，经常采用的诊断标准除传统的罗氏细菌培养还有脊柱结核综合诊断标准、病理学诊断标准及改良罗氏培养或其他病原学检测等。

4 脊柱结核主要诊断技术

脊柱结核的诊断技术主要分为以下几类：(1)细菌学检查，包括传统的罗氏细菌培养以及其他新型的细菌培养方法；(2)实验室检查，主要是检测外周血中炎症标志物水平；(3)免疫学检查，主要检测机体对MTB的特异性抗体，包括PPD试验、结核感染T 细胞斑点试验、血清MTB抗体等检查；(4)影像学检查，主要包括X线、CT、核磁共振成像以及正电子发射计算机断层显像等；(5)传统病理学检查；(6)基因诊断等。每种诊断技术的灵敏度和特异度各不相同，在对不同个体进行诊断时，也会因为个体差异，导致各项诊断结果不典型甚至相悖；且由于医疗机构条件或患者经济水平所限，以上的各种诊断技术并不能完全应用到所有患者。因此，需要综合临床表现与各诊断结果，做出更加合理的诊断。

5 基因诊断技术在脊柱结核诊断中的应用

基因诊断是利用重组DNA技术，直接从基因水平检测微生物病原体的检测手段。1972年，GOFF和 BERG完成了世界上首次DNA分子的重组，标志着基因检测技术从此诞生[10]。随着聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)及基因芯片等技术的不断出现和发展，基因诊断技术得到不断完善。此外，随着MTB基因测序的完成，基因诊断技术也将在临床结核病的诊断中得到更加广泛的应用，并被临床工作者更加接受与认可[11]。目前，临床中已经获得广泛应用的技术有 PCR直接测序鉴定法、PCR-DNA 探针鉴定法、结核杆菌利福平耐药实时荧光定量核酸扩增技术 (rifampicin resistantMycobacteriumtuberculosissemi-nested multiple real-time fluorescence quantitative system，Xpert MTB/RIF)、PCR-基因芯片鉴定法等[12]。

5.1 Xpert MTB/RIFXpert MTB/RIF是一种新型的结核病诊断技术，由美国 Cepheid 公司研发，对肺结核诊断效能较好，是诊断肺结核的重要工具。近年来，随着Xpert MTB/RIF技术的不断改良，其对肺外结核的诊断效能也在不断提高。有研究表明，Xpert MTB/RIF检测和Bactec MGIT960 培养法诊断脊柱结核的敏感度分别为 76.38%、54.60%，特异度分别为95.00%、90.00%，说明Xpert MTB/RIF对临床脊柱结核的诊断有极大的参考价值[12]。Xpert MTB/RIF除了可以检测MTB，还可以评估MTB对利福平的耐药性；RpoB 基因序列是MTB的特异性序列，反映了MTB对于利福平的耐药性，该方法以半巢式实时定量 PCR为基础检测标本中的RpoB 基因特定序列，其检测时间为 120 min左右，可以通过该基因序列的表达判断对利福平的耐药性。Xpert MTB/RIF操作简单，检测耗费时间短[13]，被WHO 推荐为检测结核病以及其对利福平耐药性的诊断技术[14]。研究表明，对椎体穿刺活检、B 超定位下穿刺、开放手术所收集的病灶组织进行Xpert MTB/RIF检测，其灵敏度分别为 44.68%、76.47%、83.78%，因此，合理使用Xpert MTB/RIF技术对阳性率高的来源标本进行检测，可以最大限度地发挥Xpert MTB/RIF的优势，获得良好的灵敏度与特异度，对脊柱结核的诊断起到重要的辅助作用，且可指导临床用药[15]。

5.2 PCR-单链探针反向杂交试验(line probe assay,LiPA)LiPA基本原理与Xpert MTB/RIF大致相同，操作步骤相似[16]。LiPA中的线性探针法临床接受度较高。目前，LiPA 是诊断脊柱结核的一种重要诊断工具，与临床中影像学、病理学及免疫学等诊断技术一致性较好。WHO在2008年正式建议使用LiPA对肺外结核进行检测。LiPA 在菌种鉴定及耐药基因检测方面也具有重要作用。随着 LiPA 技术的应用，使得结核病诊断效率明显提高。但是，目前LiPA存在价格高昂、操作繁琐、探针数量有限等诸多问题，这限制了其在临床中的普及；LiPA对取材的要求较高，而在肺外结核特别是脊柱与关节结核的诊断中，由于标本量不足及标本预处理不当，会造成结果的偏差，使LiPA检出率在临床的实际使用中阳性率较预期结果偏低。

5.3 多重PCR技术(multiplex polymerase chain reaction，MPCR)MPCR采用IS6110、蛋白 b 和 MPB64基因进行扩增，在结核性脑膜炎的诊断中表现出良好的灵敏度(86.38%)和特异度(100.00%)[17]。与痰液不同，结核性脑膜炎的标本含菌量少，与脊柱结核的标本有一定程度上的相似性，这使得 MPCR 成为诊断脊柱结核的潜在工具；与涂片和单纯 PCR技术相比，MPCR有更好的敏感度和特异度且结果获取更快速，但其对脊柱结核的诊断价值需要进一步研究。

5.4 外周血血清特异性循环微RNA(microRNA，miRNA)结核患者外周血血清特异性循环miRNA是近期的研究热点之一。miRNA作为高度保守的非编码单链RNA分子，广泛存在于真核细胞中，在细胞的代谢过程发挥生物调节作用[18]。研究表明，结核病患者血清中存在miRNA异常表达，差异化表达的miRNA可作为生物学指标应用于结核病的辅助诊断[19]。黄志刚等[20]对17种miRNA的差异化表达进行了研究，结果表明，hsa-miR-30c-5p与脊柱结核密切相关。hsa-miR-30c的潜在靶基因分别为FLT1、CXCL12、RUNX2，分别负责干细胞特性维持、间充质干细胞表型和成骨分化[21-23]。hsa-miR-30c-5p在脊柱结核的诊断中表现出较高的敏感度、特异度、准确度、阳性预测值和阴性预测值，分别可达到100.00%、96.00%、98.00%、96.15%和100.00%。外周血血清miRNA相比于细胞内miRNA，具有更好的生物学特性，是一种较为理想的生物标志物，可应用于肺结核和其他多种疾病的临床诊断[24-26]。目前，外周血血清miRNA检测因其取材标本为外周血血清，比起术中取标本及超声/CT引导下穿刺活检的创伤更小，预测其可以获得更好的依从性。

5.5 RNA实时荧光恒温扩增技术(simultaneous amplification and testing，SAT)SAT是一种恒温下可将专有核酸在30 min内扩增10亿倍的荧光检测体系，扩增倍率高。SAT检测的标靶为RNA，RNA仅在活菌中存在，在MTB死亡后其会迅速降解，因此，降低了假阳性率，且对于活动期结核的诊断意义更大[27]。但是，对于静止期或陈旧性结核的诊断灵敏度较低。在脊柱结核手术的术前准备中，大部分患者如无特殊情况，均会进行术前2～4周的规范抗结核药物治疗[28]；而经治疗后大部分脊柱结核病灶内细菌由活动期转为静止期，从而造成SAT检查敏感度有所下降[29]。采用多种诊断方法联合诊断可提高灵敏度，起到佐证作用，降低漏诊率，对于不典型的脊柱结核和静止期的脊柱结核的诊断更有必要。

总之，从病原学角度，基因诊断可以应用于各种已知基因序列的微生物的检测，随着MTB基因组测序的完成，基因诊断技术在临床中已被越来越多的工作人员熟知与认可，其在病原体检测、药物选择和疗效评估等方面具有重要作用，预测其将来会在脊柱结核的诊治中发挥重要作用。

6 总结与展望

由于脊柱结核患者早期症状不典型，易造成漏诊、误诊。目前，脊柱结核常用的诊断方法仍以临床症状及影像学检查为主，这些诊断的确立与医师和影像技师的技术和经验有关。MTB培养是诊断结核病的 “金标准”，但其耗时长、阳性率较低，且只在结核病专科医院与大型综合医院才可进行。病理学诊断的价值高，但是无手术指征患者进行病灶穿刺活检，对于标本量及取材部位均有较高要求，假阴性率较高。基因诊断技术作为一种快速发展的新型诊断技术，其在脊柱结核的诊断中发挥越来越重要的作用。如果在病理检测的同时进行基因检测，则会明显提升诊断灵敏度。随着耐药菌种的流行越来越严峻，一般抗结核治疗效果较差，易引起复发，结核病的复治难度要远高于初治难度，如果通过基因诊断技术同时对菌种和耐药基因做出检测，使用更加敏感的抗结核药物，则可显著降低患者的复治率，减少患者的经济负担，使患者在经济和健康上获得更多的收益。而且，随着科技的进步及分子生物学的不断发展，基因诊断的成本和价值也会进一步优化。