髓外白血病的生物标志物及治疗进展

隋铭泽，万科成，陈玉雯，高 源，王向文

(1.海南省人民医院儿科，海南 海口 570311；2.内蒙古自治区人民医院小儿血液科，内蒙古 呼和浩特 010017)

髓外白血病(extramedullary leukemia,EML)并不少见，病情进展的最终结果是多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome,MODS)。EML患儿往往需要重症监护，美国加利福尼亚大学医学院的一项研究显示，儿童恶性肿瘤约占儿科重症监护病房(pediatric intensive care unit,PICU)入院人数的4.2%，约占PICU死亡人数的11.4%，白血病占据其中相当一部分比例，其PICU入住率与死亡率之间的差异可能与EML引起的MODS有关[1]。EML诊疗占用了大量的医疗资源，但治疗效果并不理想，因此，国内外学者致力于寻找EML的早期诊断标志物并着手研发新的治疗手段，这对于改善EML预后至关重要。本文就近年来EML的生物标志物及治疗进展作一综述。

1 EML的生物标志物

以往对EML的评估主要依赖体格检查、影像学检查及有创操作等。然而，有相当一部分EML患儿合并不同程度的意识障碍，甚至需要有创通气，故无法离开PICU进行外出检查；另外白血病细胞过度增殖会抑制骨髓其他两系造血，患儿进行有创检查有出血风险，体格检查所能获得的临床证据又相当有限。因此，近年来国内外学者致力于寻找安全、高效的生物标志物来评估EML，并在蛋白标志物、基因标志物等领域获得了一定进展。

1.1 蛋白标志物大多数EML的蛋白标志物可以通过外周血检验获取阳性结果，相比脑脊液检查、病理活检及影像介入等更加经济、方便，同时能减轻病人痛苦。另外，由于生物屏障及化学治疗后微小残留病变(minimal residual disease,MRD)的存在，相对于骨髓形态检查，监测外周血中蛋白标志物水平显然更具优势。

1.1.1 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-9MMP是锌依赖性内肽家族成员之一，主要参与细胞外基质的重塑，MMP与EML的相关性研究最早可追溯到本世纪初。DIAS等[2]研究证实，MMP的2种亚型MMP-2和MMP-9有助于识别具有高侵袭性的白血病，其中MMP-9备受学者关注。MMP-9由BCR/ABL融合基因经磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3 kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号通路介导的转化生长因子β1诱导产生，通过降解基底膜和细胞外基质实现白血病细胞的髓外浸润[3]。MMP-9通过上述机制引发了慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)骨髓造血干细胞由静止向恶性增殖生态位转化的生物学效应；另外，MMP-9也可以通过α4β1整合素及趋化因子CXCL12在B淋巴细胞白血病的髓外浸润过程中发挥关键作用[4]。可见，无论在髓系白血病还是在淋巴细胞白血病，MMP-9均参与了髓外浸润过程，虽然诸多研究表明MMP-9在EML，特别是中枢神经系统白血病(central nervous system leukemia,CNSL)中具有早期诊断价值，但原发于髓外器官的恶性肿瘤组织中MMP-9升高的报道并不罕见[5-6]。尽管SCHNEIDER等[7]研究显示，以2 450 ng·L-1MMP-9为截断值对EML诊断具有较高的灵敏度(灵敏度87.9%，曲线下面积 0.721)，但特异度却不令人满意(特异度66.7%)。综合现有文献，未来肿瘤细胞浸润器官分泌物中MMP-9水平检测可能为解决此类问题提供思路及方向。

1.1.2 赖氨酰氧化酶(lysyl oxidase,LOX)LOX是铜依赖细胞外分泌蛋白，其编码基因位于5号染色体长臂2区3带，在缺氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)刺激下LOX在肿瘤细胞中表达增加[8]。目前普遍认为，LOX参与了上皮源性恶性肿瘤的转移机制[9-10]。近年来临床研究显示，LOX参与了儿童急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)髓外浸润的发病过程，然而LOX水平变化在EML最初诊断和髓外复发时往往被忽略[11]。德国德雷斯顿工业大学医学院一项纳入了683例AML患者的多中心临床研究显示，LOX是预测AML预后的潜在生物标志物，Cox回归模型分析结果进一步证实了伴有EML的AML患者血清中具有更高水平的LOX[12]。虽然目前针对LOX与EML的研究不如MMP-9成熟，但OSUMI等[13]报道的1例白血病细胞肾脏浸润引起的红细胞增多症被证实与HIF-1有关，LOX是否参与了被浸润器官的异常分泌或是直接参与了该器官的细胞损伤有待深入研究。

1.1.3 其他蛋白标志物髓过氧化物酶、血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等也参与了EML的发生机制。2010年，STEINER等[14]研究显示，VCAM-1可协助其他细胞因子将T淋巴细胞转运至血脑屏障内皮细胞内，从而参与CNSL的病理过程。然而SI等[15]却得出了截然相反的结论，即VCAM-1与CNSL的发生无相关性。更值得一提的是，经典的心肌损伤标志物肌钙蛋白、氨基末端脑钠肽前体等水平在白血病心脏浸润患者血清中同样升高[16]。显然，蛋白标志物用于早期诊断的特异度并不能令人满意，更适合EML的筛查，根据并联试验可以提升诊断试验特异度的统计学原理，蛋白标志物联合其他检验指标的诊断体系或将成为未来研究的选择。

1.2 基因标志物随着临床科研的飞速发展，基因诊断逐渐成为热点，基因标志物相比蛋白标志物更具有特异性，越来越多的研究成果揭示了EML的分子生物学机制，其中包括长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circular RNA,circRNA)以及微RNA(microRNA,miRNA)调控网络介导的基因表达异常。

1.2.1 lncRNA人类基因组计划研究表明，约2%的人类基因组编码了蛋白质，而超过75%的人类基因组编码了非编码RNA。lncRNA是指具有大于200个核苷酸序列的非编码RNA，其现已被证实与肿瘤细胞的转移密切相关[17]。最初，lncRNA在急性淋巴细胞白血病(acute lymphocyte leukemia，ALL)中的作用机制尚不清楚，因此无法通过微阵列分析ALL患者样本。目前，实时荧光定量聚合酶链反应技术日趋成熟，lncRNA在ALL中的表达与细胞遗传学异常得以证实。近10 a来的微阵列研究确定了TEL/AML1、E2A/PBX、ETV6/RUNX1等与lncRNA相关的ALL基因，同时也深入探讨了这些基因在EML发病中的作用机制[18-20]。例如，Rap1信号通路不仅在急性B淋巴细胞白血病(acute B-lymphoblastic leukemia,B-ALL)中高度富集，同时也参与了急性T淋巴细胞白血病(acute T-lymphocyte leukemia,T-ALL)的组织侵袭[21-22]。XIU等[23]研究表明，血管内皮生长因子A/血管内皮生长因子受体-1信号通路可增强白血病细胞的迁移和存活，从而实现白血病细胞的髓外浸润及免疫逃逸。另外，PI3K/PKB/NF-κB与Rap1信号通路的作用机制相似，提示了某些蛋白标志物与 lncRNA的协同作用[24]。近年来学者发现了大量ALL相关的新基因，但其中与EML相关的文献报道较少，作为新兴标志物，lncRNA家族数量庞大，测序工作纷繁复杂，健全lncRNA临床数据库仍任重而道远。

1.2.2 circRNA最初circRNA被认为是错误剪接的结果[25]，而高通量测序的临床应用逐渐推翻了该猜想，近年来研究显示，circRNA可充当miRNA海绵参与调节亲本基因的表达，circRNA失调控的可能导致恶性肿瘤的发生和进展[26]。LV等[27]首次应用circRNA微阵列和全基因组表达及生物信息学工具研究AML患者髓外浸润的circRNA/miRNA/基因调控网络，发现663个基因上调和838个基因下调，并最终确定LRRK1、PLXNB2、OLFML2A、LYPD5、APOL3、ZNF511及ASB2共7个与EML预后相关的基因标志物。LIN等[28]深入分析了PLXNB2 基因表达过程中circRNA与EML的相关性，结果发现，circPLXNB2表达与PLXNB2 mRNA表达呈正相关，因此，circPLXNB2可作为AML新的预后预测因子和治疗靶点。目前，circRNA与EML的相关研究多集中于AML，虽然儿童ALL患者中circRNA有关的基因标志物已有报道，同时也有研究发现了circRNA参与ALL发病的信号传导通路，但 circRNA 在ALL髓外病变方面的研究成果尚未见文献报道[29-30]。

1.2.3 miRNAmiRNA是具有20～25个碱基序列的非编码RNA，在细胞分化、增殖、迁移和凋亡等过程中起着至关重要的作用。miRNA可作为癌基因或肿瘤抑制因子参与白血病的病理生理过程。一项纳入了186例ALL患儿的回顾性分析显示，无论中枢神经系统受累情况如何，体内组织炎症应激性miRNA(miR-181a)家族表达水平在脑脊液中显著高于骨髓及外周血，这种差异在CNSL患儿中愈发明显，后续的队列研究进一步确认了miRNA对CNSL的诊断价值[31]。该研究虽未进一步发掘miRNA的分子机制，但很大程度上提示了miRNA有着高度的组织特异性。同样，miRNA在AML髓外浸润中也发挥重要作用，JIANG等[32]研究显示，miR-144可经磷酸化细胞外信号调节激酶/c-Myc蛋白/MMP-2途径介导AML的白血病细胞髓外浸润。值得一提的是，miRNA与lncRNA同为非编码RNA，二者的关系类似circRNA之于miRNA的海绵作用，许多lncRNA具有多个miRNA应答元件[27，33]。另外，利用干扰小RNA敲除目的基因后EML发生率明显降低[34]。因此，lncRNA、circRNA及miRNA在EML的发病中更像是作为一个整体调控网络发挥生物学效应。

2 EML的治疗方案

EML一直是白血病治疗的难题，一方面，血液流经全身各个脏器增加了EML风险；另一方面，化学治疗药物难以透过血脑屏障、血睾屏障等而发挥作用。最初人们尝试通过颅脑放射治疗、手术切除等治疗CNSL及白血病性睾丸肿瘤，然而，对于青少年、儿童等特殊群体，放射治疗的不良反应及生殖器官切除严重影响患者的生活质量和社会心理适应能力。近年来，在多中心临床研究及荟萃分析等循证医学证据的支持下，抗肿瘤药物鞘内注射已被纳入诊疗指南，同时，随着越来越多的生物标志物被发现，各种类型EML的分子靶向治疗正逐渐成为国内外学者关注的焦点。

2.1 放射治疗绿色瘤是AML的EML类型之一，眼眶受累最为常见，其发病隐匿，部分AML患者可以此为首发表现[35]。绿色瘤侵犯眼眶多伴有不同程度的组织粘连，且眼及周围器官血流丰富，相对于外科手术，放射治疗更为合适。2018年国际淋巴瘤放射肿瘤学组髓外白血病放射治疗指南(绿色瘤)推荐总剂量24 Gy，分为12次连续照射，该方案适用于大多数患者，但该指南依旧认为放射剂量的选择应取决于临床情况，对于不能耐受的患者，可降低总剂量至6～20 Gy[36]。睾丸浸润常见于ALL，血睾屏障充当了白血病细胞的“庇护所”，对于儿童及有生育需求的年轻患者可选择放射治疗，BAKST等[37]推荐的放射剂量为26 Gy(4～42 Gy)，约71%的患者可达到完全缓解，总生存期为24个月，且高剂量组与低剂量组的疗效无显著差异。儿童白血病性睾丸肿瘤的治疗国内指南首推放射治疗，双侧睾丸放射治疗剂量为20～26 Gy，婴幼儿以12～15 Gy为宜[38]。虽然放射治疗对于某些EML类型效果显著，但电离辐射引起的损伤不可避免，甚至有继发其他恶性肿瘤的可能[39]。

2.2 化学治疗血脑屏障的存在使得静脉输注的化学治疗药物无法进入中枢神经系统发挥细胞毒作用，因此，血液与肿瘤医师处理CNSL的思路也有所转变，其中CNSL的阿糖胞苷(cytosine arabinoside,Ara-C)+甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)+地塞米松(dexamethasone,DXM)三联鞘内注射治疗方案取得了国内外专家学者的一致认可。国内相关规范主张初诊早期即进行CNSL防治，按不同年龄谱推荐鞘内注射剂量，<12个月患儿给予Ara-C 12 mg+MTX 6 mg+DXM 2 mg，12～24个月患儿给予Ara-C 24 mg+MTX 8 mg+DXM 2.5 mg，>24～36个月患儿给予Ara-C 30 mg+MTX 10 mg + DXM 3 mg，>36个月患儿给予Ara-C 36 mg+MTX 12 mg+DXM 4 mg；对于脑脊液存在腰椎穿刺无损(红细胞白细胞≤1001)且白细胞≤5×106L-1并见到明确的白血病细胞、腰椎穿刺有损(红细胞白细胞>1001)且可见白血病细胞、腰椎穿刺有损的血性脑脊液且初诊白细胞>50×109L-1之一，即脑脊液分级为2级以上者在诱导早期增加1～2次鞘内给药，共计17～26次[38]。除大剂量MTX治疗外，化学治疗药物鞘内注射对于白血病性睾丸肿瘤的治疗同样有效[40]。然而不可忽视的是，经腰椎穿刺术鞘内注射为有创操作，操作过程中会损伤血管，白血病细胞是否会进入中枢神经系统造成人为CNSL，尚有待商榷。

2.3 分子靶向治疗20世纪60年代，伊马替尼获批上市标志着肿瘤治疗进入分子靶向治疗时代，随着EML发病机制的逐渐明晰，越来越多潜在治疗靶点也随之被报道[27]。越来越多的研究表明，EML几乎均伴随基因水平及相关信号通路异常，在临床研究过程中发现新的EML生物标志物与立足于此寻找能够逆转癌基因表达的相关酶抑制剂完美契合。目前已有多种用于EML治疗的靶向药物获批上市，如抗血管生成的血管内皮生长因子受体2、酪氨酸激酶抑制剂阿帕替尼、抑制细胞分化的组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古抑菌素A、抑制肿瘤细胞向骨髓外迁移的趋化因子受体CXCR4抑制剂普利沙福及直接识别、杀伤肿瘤细胞的CD22靶向识别剂奥英妥珠单抗等；同时，尚有一些仍在临床试验阶段的制剂已被证实有效，如抑制PI3K/Akt信号通路的PI3K抑制剂LY294002、抑制内皮细胞凋亡的p38MAPK抑制剂SB202190、抑制肿瘤细胞向中枢神经系统迁移的VCAM-1配体抑制剂TCB3486及抑制肿瘤细胞脑黏附的造血干细胞动员化合物Me6TREN等，尽管这部分药物的研究尚处于临床试验阶段，但结合最新文献，这些靶向药物使更多的EML患者受益应该只是时间问题[41-46]。

2.4 嵌合抗原受体修饰T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cell,CAR-T)疗法和造血干细胞移植CAR-T疗法是通过体外重组并转染患者T细胞，使患者T细胞表达肿瘤抗原以精准识别、杀伤肿瘤细胞，但对EML的疗效不佳，这迫使人们在面对EML时改进CAR-T方案。WENG等[47]以1928z慢病毒载体转染T淋巴细胞，同时引入部分Toll样受体2(Toll-like receptor 2,TLR2)的结构域，产生了靶向CD19的1928zT2CAR-T，TLR2是一种典型的共刺激受体，与之结合后的1928zT2CAR-T的功能显著改善。LIU等[48]在国内首次应用靶向CD19的CAR-T成功治疗EML患者，在接受CD19CAR-T治疗后46 d患者接受异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT)，随访未见EML复发迹象，CD19 CAR-T治疗可能是桥接化学治疗与allo-HSCT的良好媒介。MRD是allo-HSCT面临的重大临床问题，大部分MRD来源于EML，这也是白血病髓外复发的重要原因之一。HU等[49]认为，在MRD引导治疗的基础上，allo-HSCT可能会改善高危儿童t(821)AML及其EML的预后，但EML患者在接受allo-HSCT 前仍需监测骨髓形态及MRD。目前，allo-HSCT 是有望治愈白血病的手段之一，尽管中枢神经系统浸润在CML患者中极为罕见，但已有研究肯定了allo-HSCT在CML中枢神经系统受累中的价值[50]。总之，消除EML并达成临床治愈是白血病治疗的最终目的，个体化方案的制定有利于提升患者的生活质量及生存希望。

3 小结与展望

EML诊断的生物标志物与治疗方案相辅相成，随着环境改变疾病本身也会发生相应变化，每发现有新的致病基因，必有新的信号传导通路以及蛋白质水平变化被随之发现，着手于此研发的靶向药物也不断问世。虽然三联鞘内注射治疗方案早期应用取得了一定的效果，其他类型的EML也应该在出现严重临床后果之前被预防，期待未来生物标志物能够在EML的三级预防中发挥潜能，也期待更多的精准治疗手段进入Ⅲ期临床试验。