喷施3种商品化纳米颗粒对黄瓜绿斑驳花叶病毒病的防效初探

罗金燕， 谢婷， 陈磊， 杜伟， 张健男， 朱洁， 安千里， 李斌*

(1.上海市农业技术推广服务中心， 上海 201103； 2.浙江大学 生物技术研究所， 浙江 杭州 310058；3.宁夏回族自治区农业技术推广总站， 宁夏 银川 750001； 4.温州市植物保护与土壤肥料管理站， 浙江 温州 325000)

黄瓜绿斑驳花叶病毒在世界范围内分布广泛，其寄主主要为葫芦科作物，对瓜类作物危害极大。危害西瓜时，前期主要症状为花叶斑驳，在西瓜生长后期还可能引起果肉组织严重纤维化导致空腔，形成“倒瓤”，严重影响果实的食用与经济价值[1]。CGMMV一旦暴发就会给西瓜产业造成巨大经济损失。据报道，2005年我国辽宁盖州CGMMV大暴发，造成当地西瓜大面积绝收[2]。CGMMV可稳定存在于种子表皮与内种皮，带毒种子是CGMMV传播的主要途径，目前生产上主要以种子干热消毒预防为主，辅以药剂等手段进行综合防控，但干热消毒通常影响种子活力。

纳米颗粒通常是指被定义为1～100 nm的粒子，由于其独特的理化特性和良好的抗菌性能，近年来在农业生产上被广泛使用，为病害绿色防控提供了新策略。氧化锌纳米颗粒(ZnO NPs)和二氧化硅纳米颗粒(SiO2NPs)对人体无毒且易于制备，有研究[3]表明，ZnO NPs或SiO2NPs可通过直接影响病毒和提高植物自身的防御能力来保护本氏烟免受TMV侵害。二氧化钛纳米颗粒(TiO2NPs)也是最常制备的纳米颗粒之一，研究[4]表明，TiO2NPs可能通过激发活性氧(ROS)产生来防治植物病害。这些研究证明纳米颗粒在植物病毒防控中具有较好的潜力。

本研究选用ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs这3种商品化的纳米颗粒，制备成2 mmol·L-1的溶液对健康西瓜植株进行叶面喷施，连续处理3 d后接种CGMMV，以无菌水处理为对照，待植株发病后检测各个处理组植株的生物量、叶绿素含量与病毒积累量，以此初步探究商品化纳米颗粒对CGMMV的防控效果。

1 材料与方法

1.1 供试西瓜品种和纳米材料

供试西瓜品种为市购的早佳8424西瓜种子。供试纳米材料：ZnO NPs(平均粒径为30 nm)(上海麦克林生化科技有限公司)；TiO2NPs(平均粒径为20 nm)(上海麦克林生化科技有限公司)；SiO2NPs(平均粒径为30 nm)(上海超威纳米科技有限公司)。

1.2 供试西瓜植株的处理

用玻璃瓶盛2/3体积的蒸馏水，取适量供试西瓜种子倒入玻璃瓶中，50 ℃水浴40 min，在育苗盘中铺一层用蒸馏水润湿的尼龙纱布，将西瓜种子放在上面并置于28 ℃温箱中催芽2～3 d，发芽的西瓜种子移栽到花盆里，置于28 ℃，光照16 h，黑暗8 h的温室中生长。

1.3 纳米颗粒的喷施

当西瓜幼苗长至二叶一心期，将ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs 这3种商品化纳米颗粒分别配制成终浓度为2 mmol·L-1的悬浮液，超声振荡30 min使纳米颗粒完全分散，在西瓜真叶叶面喷施，用量为5 mL，对照植株喷施等量无菌水(ddH2O)；连续喷施3 d，让纳米颗粒渗透到植物体内，每个处理选用10株西瓜苗，设置3个重复，以确保数据的重现性。

1.4 CGMMV的接种

第3天喷施纳米颗粒的西瓜幼苗，在处理后的24 h内接种CGMMV。具体方法为取系统感染CGMMV的西瓜老叶，将植物叶片按照1∶10的比例(m/V，g·mL-1)在接种Buffer(0.01 mol·L-1PBS)中研磨成匀浆，在800目石英砂覆盖的两片西瓜真叶上摩擦接种CGMMV；接种病毒后的西瓜苗移至防虫温室中，设置生长参数为：光照28 ℃，16 h；黑暗25 ℃，8 h；湿度为75%；1～2周植株发病后通过调查病毒的增殖和西瓜植株的发病严重程度以及生物量、叶绿素含量等生理指标的变化，以评估各纳米颗粒对CGMMV感染的影响。

1.5 生物量的检测

1～2周植株发病后，分别测量各个组别的株高、总鲜重、总干重。将植株的根际土壤洗干净，擦干后测量ZnO NPs、TiO2NPs、SiO2NPs、对照4个处理组的株高、鲜重；将新鲜植株用锡箔纸包裹，放置于烘箱中105 ℃烘48 h以上，至质量不再变化后测量该恒重，从而计算出各个组别的干重。

1.6 叶绿素含量的检测

待1～2周植株发病后，将每个处理组植物的第4片真叶混合形成一个生物重复，采用80%丙酮浸提比色法[5]提取叶绿素，利用紫外分光光度计测定色素提取液在波长663 nm和645 nm处的吸光度，以80%丙酮作为空白对照调透光率100%，每个样品重复测定3次。将测得的吸光度(D)代入公式(1)、(2)、(3)中，计算叶绿素a、b浓度与总浓度，再将叶绿素a、b浓度与总浓度代入公式(4)中求出所测材料单位的叶绿素a、b含量与总含量。

叶绿素a=12.7×D663-2.69×D645；

(1)

叶绿素b=22.9×D645-4.68×D663；

(2)

叶绿素a+b=20.21×D645+8.02×D663；

(3)

叶绿素总含量=(叶绿素a+b)×V÷1 000×m×n。

(4)

式中:V为提取液总体积；m为取样鲜重;n为稀释倍数。

1.7 CGMMV外壳蛋白基因的表达

通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测植株CGMMV基因表达，以判断植株是否被病毒侵染。接种后7 d采集叶片样本，将每个处理植物的叶子混合形成一个生物重复。利用TRIzol法提取西瓜叶片的总RNA，电泳检测RNA的完整度，以提取的总RNA为模板合成cDNA，以合成的cDNA作为RT-PCR的模板，使用CGMMV外壳蛋白特异性引物[6](CGMMV-F/R：5′-ATGGCTTACAATCCG ATCACAC-3′/5′-CTAAGCTTTCGAGGTGGTAGCC-3′)进行RT-PCR。

1.8 CGMMV病毒粒子的ACP-ELISA检测

通过ACP-ELISA方法定量检测CGMMV病毒的含量。具体方法是先将植物组织按1∶20比例(m/V，g·mL-1)在1×PBS中研磨成匀浆，离心后将上清加于96孔ELISA微孔板上(每孔100 μL)，4 ℃过夜包被，每个处理3次重复。参考何宛芹[7]的方法进行ACP-ELISA，略有改动，使用CGMMV一抗(1∶5 000倍稀释)，在显色时使用AP显色底物溶液；显色完成终止反应后，用酶标仪(Bio-Rad 680)进行光密度吸光值D405的测量，每个实验重复3次。以上试验数据均采用邓肯式新复极差法(DMRT)进行分析和显著性测定。

2 结果与分析

2.1 纳米颗粒处理对西瓜生物量的影响

接种1～2周后，西瓜植株出现CGMMV症状，但处理组和对照组病害症状差异不明显；长势观察发现3种纳米颗粒处理的植株株高与对照组植株相比无显著差异；ZnO NPs处理植株与对照植株的生物量相比也无明显差异，但TiO2NPs和SiO2NPs处理的西瓜植株长势明显优于对照(图1)，说明体外喷施这2种商品化纳米颗粒可以增加感染CGMMV西瓜植株的总鲜重和总干重，2个处理组别的总鲜重与总干重均显著高于对照组(表1)。

图1 喷施纳米颗粒对感染CGMMV西瓜植株长势和叶片的影响

2.2 纳米颗粒处理对叶绿素含量的影响

CGMMV侵染的一个典型症状就是植株叶片褪绿黄化，因此，叶绿素含量的检测不仅可以评判植株长势，也能在一定程度上反映植株感染CGMMV的发病程度。将每个处理植物的第4片真叶混合形成一个生物重复，采用80%丙酮浸提比色法检测叶绿素含量。结果表明，在感染CGMMV的情况下，体外喷施商品化ZnO NPs的西瓜植株叶绿素含量与对照植株无明显差异；但喷施商品化TiO2NPs、SiO2NPs的西瓜植株叶绿素含量显著高于对照植株(图1、表1)。

表1 不同纳米颗粒处理对感染CGMMV西瓜植株生物量、叶绿素含量和带病毒量的影响

2.3 纳米颗粒处理对外壳蛋白基因表达的影响

凝胶电泳检测发现利用TRIzol法提取的RNA较为完整(图2中A)，通过RT-PCR在各个纳米颗粒处理和对照组均扩增到了CGMMV特定的 486 bp 片段，从一定程度上证实了所有测试的西瓜植株均被CGMMV成功感染(图2中B)。

A—总RNA；B—RT-PCR图2 纳米颗粒处理感染CGMMV西瓜植株的外壳蛋白表达

2.4 纳米颗粒处理对CGMMV含量的影响

ACP-ELISA中测得的D405值表示植株中含有的CGMMV外壳蛋白与CGMMV特异性抗体的结合量，即可以表征各个处理组CGMMV病毒外壳蛋白的积累量。结果(表1)显示，与对照组相比，TiO2NPs、SiO2NPs和ZnO NPs预处理的西瓜植株CGMMV外壳蛋白积累量均显著低于对照，表明这3种纳米颗粒对CGMMV繁殖有一定的抑制作用。

3 小结

本研究测定了在西瓜叶面喷施ZnO NPs、TiO2NPs和SiO2NPs这3种商品化纳米颗粒对系统感染CGMMV西瓜植株的生物量、叶绿素含量以及病毒积累量的影响，结果表明，经过TiO2NPs和SiO2NPs处理的植株在感染CGMMV后的长势优于无菌水对照植株，具体表现为植株总鲜重和总干重比对照组显著增加，但各纳米颗粒处理组与对照组的株高无明显差异。此外，体外喷施TiO2NPs和SiO2NPs的感染CGMMV西瓜植株的叶绿素含量显著高于对照植株，而ZnO NPs处理植株的生物量、叶绿素含量与对照植株无显著差异。研究还发现，连续3 d叶面喷施3种纳米颗粒可显著降低CGMMV外壳蛋白积累量，初步推测可能是通过破坏CGMMV的方式减少了病毒的复制增殖。TiO2NPs和SiO2NPs增加西瓜植株生物量与叶绿素含量或许是因为他们诱导了植物的抗病能力，从而部分抵消植株因病毒侵染所带来的负面影响。

在农业生产中，纳米颗粒的使用已被报道可以减少病原体的数量、控制病害和杂草以及提高作物的生长速度[8]，但其仅在一定的浓度内对植物有益，过高浓度的纳米颗粒也可能会对作物产生毒性。有研究表明，在300 mg·L-1TiO2NPs剂量水平下玉米的叶片生长受阻[9]。而本研究使用的纳米材料浓度相对较低，基本上不会抑制植物的正常生长发育。与较大的颗粒相比，纳米颗粒具有更高的表面体积比，这不仅增加了纳米颗粒的渗透性，还增强了其与组织和细胞的相互作用，渗入植株的纳米颗粒还可能为植物提供生长有益的微量元素从而起到促进植物生长的作用。下一步研究可以着重关注纳米颗粒直接喷施健康植株对植物长势与病程相关基因的表达变化。

CGMMV作为种传的植物病毒病害，最有效措施是加强植物检疫，选用无毒良种，力求将病毒封锁在种植区外；一旦发生防治起来尤为困难，故生产上应以预防为主。本研究结果表明，叶面喷施商品化纳米TiO2和SiO2颗粒在病毒侵染初期可以对植物起到一定的保护作用，对病毒的复制增殖也有一定抑制作用。相对于一些化学药剂见效快，但治标不治本，且可能对植物产生药害或抗药性等副作用，纳米颗粒往往具有对环境友好的杀菌杀毒特性，在病原细菌与真菌防控领域已初有成效，本研究表明，纳米颗粒可能直接作用于CGMMV或间接诱导植物抗性，将来有望为CGMMV等植物病毒的防控提供一种有前景的替代方案。