高效液相色谱串联质谱法同时测定化妆品中苔黑醛和氯化苔黑醛

黄键，孙雪婷，王晓颖，高雪梅，王红卫，王金娟，康琴

（南通海关综合技术中心，江苏南通 226004）

为了提高化妆品对消费者的吸引力，生产商除了在包装设计上别出心裁，还会在产品中添加各种气味独特的香精与香料，让化妆品带有独特的香气。一般说来，从动植物中提取的天然香料具有独特的天然香韵与特有的定香作用，是合成香料难以媲美的，因此一些市售化妆品会在其中添加天然提取物，以提升其产品的品质。苔黑醛和氯化苔黑醛是天然香料橡苔和树苔提取物中的核心香味成分，是具有很强穿透力的木香，以往橡苔与树苔提取物常用于化妆品的调香。然而，化妆品中添加的香精与香料是导致人体过敏的源头之一，其可能会引起各种皮肤过敏的症状[1-2]，如皮肤干裂、出疹或发炎等，因此香精与香料在化妆品中的合理使用越来越受到人们的关注。根据欧盟数据显示，苔黑醛和氯化苔黑醛可能会引发过敏，一小部分欧洲人会对这两种成分产生皮肤过敏的症状，因此欧盟发布2017/1410 号法规[3]，禁止在化妆品中添加这两种香料。

目前，针对化妆品中致敏性香料的主要分析技术有气相色谱法[4-5]、气相色谱质谱联用法[6-8]、气相色谱串联质谱法[9-10]、液相色谱法[11-14]、液相色谱质谱联用法[15-17]等。针对苔黑醛和氯化苔黑醛，已报道的方法主要有气相色谱法[5]、气相色谱质谱联用法[8]和液相色谱法[12]，利用高效液相色谱串联质谱对二者进行定量分析的方法目前未见报道。笔者采用高效液相色谱串联质谱法同时对苔黑醛和氯化苔黑醛进行检测，建立一套简便可行、准确度高的检测方法，以期为同时检测化妆品中的致敏性香料提供一定的参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪：TSQ Quantum Ultra型，美国赛默飞世尔科技公司。

分析天平：BS 224S 型，感量为0.000 1 g，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。超纯水机：Direct-Q型，德国默克密理博公司。涡旋混合仪：LAB DANCE S25 型，德国IKA公司。

超声波仪：KQ-50E 型，昆山市超声仪器有限公司。

离心机：TG16 型，屹谱仪器制造（上海）有限公司。

苔黑醛标准品：纯度（质量分数）为92.6%，CAS号为526-37-4，广州佳途科技股份有限公司。

氯化苔黑醛标准品：纯度（质量分数）为99.0%，CAS号为57074-21-2，上海安谱实验科技股份有限公司。

甲醇：色谱纯，美国天地有限公司。

高纯氩气：纯度（体积分数）大于99.999%，南通天源气体有限公司。

实验用水为去离子水（电阻率不小于18 MΩ·cm），自制。

化妆品样品：部分为市售化妆品，部分为南通口岸进出口化妆品。

1.2 溶液配制

标准贮备液：质量浓度约为1 000 mg/L，分别精确称取0.01 g 苔黑醛和氯化苔黑醛，加入甲醇溶解后转移至2 只10 mL 容量瓶中，再用甲醇稀释后定容至标线，摇匀，于4 ℃下约可保存3个月。

混合标准储备液：质量浓度约为1 mg/L，分别移取100 µL 苔黑醛和氯化苔黑醛标准储备液至同一只100 mL 容量瓶中，用甲醇稀释后定容至标线，摇匀，现用现配。

系列混合标准工作溶液：精确移取1 mL混合标准储备液至10 mL 容量瓶中，用甲醇稀释后定容至标线，摇匀，得到质量浓度为100 µg/L 的混合标准工作溶液，再将其逐级稀释，配制成质量浓度均分别为5、10、20、50、100 µg/L 的系列混合标准工作溶液，现用现配。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 液相色谱仪

色谱柱：ZORBAX SB-C18柱（150 mm×2.1 mm，5 µm，美国安捷伦科技有限公司）；柱温：25 ℃；进样体积：25 µL；流量：250 µL/min；流动相：A相为水，B相为甲醇，梯度淋洗；梯度淋洗程序：0～2 min，20% ～80% B；2～8 min，80% B；8～9 min，80%～20% B；9～12 min，20% B。

1.3.2 质谱仪

电离模式：电喷雾电离（ESI）；扫描模式：负离子模式；喷雾电压：-3 000 V；离子源温度：300 ℃；离子传输管温度：270 ℃；鞘气流量：9 L/min；雾化气流量：2.4 L/min；碰撞气：氩气；数据采集模式：选择反应监测（SRM）模式。

苔黑醛和氯化苔黑醛经化合物优化后的质谱分析参数见表1。

表1 苔黑醛和氯化苔黑醛优化后的质谱参数

1.4 实验方法

称取样品1.0 g（精确至0.1 mg），置于15 mL 塑料离心管中，加入7～8 mL甲醇，涡旋混匀，待样品全部溶解后，再加入甲醇至10 mL，涡旋1 min后，将离心管放至超声波仪中，提取15 min，然后将离心管放至离心机中，以8 000 r/min 转速离心分离5 min，最后取上清液过0.22 µm有机滤膜后，备用。

2 结果与讨论

2.1 分析方法的选择

苔黑醛和氯化苔黑醛是酚类化合物，二者的化学结构中均含有两个酚羟基，具有一定的极性。已报道的分离方法有气相色谱法和液相色谱法。研究表明通用型气相色谱柱HP-5MS柱对二者可有效进行分离[8]，但色谱峰形不理想。采用DB-17MS色谱柱时，二者峰形会得到较大改善，但在使用气相色谱法分离时发现，进样口温度过高会导致氯化苔黑醛部分分解，降低进样口温度后会导致气化率不足，使得检测灵敏度下降。采用气相色谱质谱联用法测定苔黑醛和氯化苔黑醛，进样口温度为220 ℃，方法检出限为2 mg/kg[8]。

苔黑醛和氯化苔黑醛是弱酸性化合物，易溶于水、乙腈和甲醇等极性溶剂，采用反相C18色谱柱，通过适当优化色谱条件，即可将二者进行分离，同时色谱峰形理想。

在实际检测中，也可以通过调节色谱条件以实现二者与样品中的干扰物有效分离。不过受限于DAD 检测器的灵敏度，液相色谱法的定量限为5 mg/kg[12]，因此选择液相色谱对二者进行分离，使用串联质谱对其进行检测，整个过程无需衍生化，无需净化样品，操作简便。同时，二级质谱可排除基质的干扰，且具有较高的灵敏度。

2.2 色谱条件选择和优化

苔黑醛和氯化苔黑醛可采用ZORBAX SB-C18液相色谱柱进行分离，且色谱峰形较为理想，分别在5.23 min 和5.78 min 出峰。甲醇和乙腈均是液相色谱法中常用的有机溶剂，试验发现，使用这两种溶剂得到的色谱图并无显著差别，考虑到乙腈价格较高且毒性较强，最终选择成本更低、对人体伤害更小的甲醇。

由于苔黑醛和氯化苔黑醛的分子结构中均含有酚羟基，考虑液相条件时应使用酸性流动相以获得更为理想的色谱峰形，但是酸性条件会抑制化合物电离，导致质谱信号减弱，试验分别采用水-甲醇体系、5 mmol 乙酸铵溶液-甲醇（酸性）体系和5 mmol乙酸铵溶液-甲醇（碱性）体系对二者的分离效果进行比较，结果表明上述几种流动相得到的色谱图并无显著差别。最终选择水-甲醇体系作为流动相，在实际操作中，可省去配制盐溶液、调节pH的过程，提高实验效率。

2.3 质谱条件优化

苔黑醛和氯化苔黑醛均为弱酸性物质，在溶液中电离为阴离子，因此在质谱中可采用负离子模式进行分析。ESI是液质联用法中最为常见的电离模式，应用范围较广，因此选用ESI-模式对二者进行离子化。通过进行化合物优化可知，苔黑醛的母离子为m/z150.9，其碎裂后的碎片离子主要有122.9、79.0、148.9 和80.9 等，选择优化后丰度较高的m/z122.9 和m/z79.0 作为监控离子。氯化苔黑醛的母离子为m/z184.9，其碎片离子主要有156.9、92.9、182.8 和120.9 等，最终选择m/z156.9 和m/z92.9 作为监控离子。混合标准溶液的SRM 色谱图如图1所示。

图1 混合标准溶液的SRM色谱图

2.4 提取溶剂的选择

甲醇、乙醇、乙腈或四氢呋喃等极性溶剂是化妆品检测时溶解基质、提取目标物质较为常用的试剂。苔黑醛和氯化苔黑醛分子结构中均含有酚羟基，显示为弱酸性，在甲醇、乙醇、乙腈、水等极性溶剂中均能溶解。为匹配流动相，采用甲醇作为提取溶剂对样品进行前处理。试验发现，加入甲醇溶解样品后，溶液为均匀的悬浊液或澄清溶液，高速离心后上层溶液澄清易于过膜，且加标回收率令人满意。空白化妆品样品与加标样品的色谱图分别见图2与图3。由图2、图3可知，在目标峰的位置附近，样品中无干扰峰出现，并且样品色谱图几乎没有杂峰，说明采用甲醇作为提取溶剂的共提物杂质较少，且二级质谱可有效降低基质中干扰物对待测物质的影响。

图2 空白化妆品色谱图

图3 空白加标样品色谱图

2.5 线性方程与检出限

按1.2 中方法配制系列混合标准工作溶液，按1.3 仪器工作条件从低浓度到高浓度依次测定。以得到的色谱峰面积（y）为纵坐标、对应的质量浓度（x）为横坐标，将系列混合标准工作溶液的数据进行线性拟合，绘制标准工作曲线，并分别计算两种化合物的线性方程和线性相关系数。按实验方法对加入不同浓度混合标准溶液的空白样品进行测定，按3倍信噪比为检出限。苔黑醛和氯化苔黑醛的线性范围、线性方程、相关系数及检出限见表2。由表2 可知，苔黑醛和氯化苔黑醛在质量浓度在5～100 µg/L范围内与色谱峰面积的线性关系良好，相关系数均大于0.999，检出限均为10 µg/kg。

表2 苔黑醛和氯化苔黑醛的线性参数及检出限

2.6 加标回收与精密度试验

选用空白化妆品为基质，按1.4实验方法进行加标回收和精密度试验，加标量为50、200、500 µg/kg 3个浓度水平，每个水平测定6次，试验结果见表3。由表3 可知，苔黑醛和氯化苔黑醛的平均回收率为80.6% ～ 89.8%，测定结果的相对标准偏差为1.1% ～2.0%（n=6），结果均符合要求，表明该方法具有良好的精密度和较高的准确度。

表3 空白样品加标回收率与相对标准偏差

3 结语

采用液相色谱串联质谱法对化妆品中的苔黑醛和氯化苔黑醛进行了分离和测定。化妆品样品用甲醇溶解，超声提取，过膜后直接进样，以水-甲醇为流动相，使用ZORBAX SB-C18液相色谱柱，在12 min内成功实现了上述2种化合物的分离检测。方法检出限均为10 µg/kg；测定结果的相对标准偏差均不大于2.0%。该方法操作简便，回收率高，为化妆品中苔黑醛和氯化苔黑醛的筛查和测定提供了一定的借鉴。