Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM在弥漫大B 细胞淋巴瘤中的表达及预后意义

孙晓梅，梅 雯，何 冰，罗中贵，孙如丽，熊 伟，赵 一*

（1.楚雄彝族自治州人民医院病理科，云南楚雄 675000；2.大理大学基础医学院，云南大理 671000）

弥漫大B 细胞淋巴瘤（diffuse large B cell lymphoma，DLBCL）是淋巴造血系统最常见的恶性淋巴瘤之一，是非霍奇金淋巴瘤最常见的类型，占非霍奇金淋巴瘤的30%～40%〔1〕。DLBCL 具有高度侵袭性和异质性，可发生于结内或结外任何部位，病情进展快、恶性程度高。若同一病例出现MYC 与Bcl-2 异位或MYC 与Bcl-6 异位称其为“双打击”淋巴瘤；若MYC、Bcl-2、Bcl-6 三者基因重排同时阳性，则称其为“三打击”淋巴瘤，“双打击”淋巴瘤和“三打击”淋巴瘤恶性度高、化疗效果和预后均较差〔2-3〕。利妥昔单抗联合CHOP（以下简称“RCHOP”）化疗方案大大提高了DLBCL 患者的完全缓解率及5 年生存率，但由于DLBCL 具有异质性、复杂免疫表型及分子遗传学等，部分难治性复发患者的治疗效果并不理想，仍然严重影响着患者生存率〔4〕。目前对于难治性复发患者，干细胞移植是一种有效的治疗方法，由于许多患者不符合干细胞移植条件，限制了它的应用〔5〕。因此，研究DLBCL 发病机制及预后相关指标对于治疗方案的选择具有重要的指导意义。

线粒体转录延伸因子（mitochondrial transcription elongation factor，TEFM）又称为C17orf42，是对细胞周期调控、细胞增殖及凋亡调节具有重要作用的蛋白因子，在线粒体DNA 的转录过程中起正调控作用，TEFM 为mtDNA 复制提供引物，在线粒体转录延伸和抗转录终止中发挥调节作用，对细胞能量代谢至关重要〔6〕。王唯斯等〔7〕基于生物信息数据库分析发现TEFM mRNA 在脑胶质瘤中高表达，其表达量与世界卫生组织分级、病理类型具有相关性，提示TEFM 基因在细胞内的功能可能类似于细胞癌基因。DLBCL 在能量代谢方面存在明显异质性，线粒体与DLBCL 的发生、发展过程密切相关，或许能为DLBCL 的治疗提供理论指导和新的策略〔8〕。研究〔9〕表明，BCR 信号通路、Bcl-6 和自噬等调节BCR-DLBCL 亚型细胞的有氧糖酵解过程，高度活化的线粒体功能基因和高表达的脂肪酸代谢关键基因等调节OxPhos-DLBCL 亚型细胞的氧化磷酸化过程。Ki-67 为淋巴瘤增殖活性指标，Bcl-6 是凋亡抑制因子，功能与Ki-67 相似。Bcl-6 基因突变和染色体易位是肿瘤发生的基础，异常表达Bcl-6 可直接调节细胞分化、增殖和凋亡，促进肿瘤生长。Bcl-2 是一种抗凋亡分子，其过表达使细胞抵抗正常凋亡，从而具有致瘤作用。TEFM 是一种促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的蛋白因子，在线粒体基因转录调控中发挥重要调节作用。Ki-67、Bcl-6 及Bcl-2均对DLBCL 细胞增殖及凋亡起重要调控作用，它们是否与其他肿瘤增殖因子如TEFM 相互作用共同参与DLBCL 的发生、发展有待进一步证实。基于此，本研究旨在探讨Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 在DLBCL 中的表达及其与患者临床病理特征的相互关系，为DLBCL 的临床诊断和治疗提供理论依据。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集楚雄彝族自治州人民医院DLBCL 病理组织样本41 例和反应性增生淋巴组织样本42 例，记录上述样本对应患者的临床病理参数信息和预后信息。诊断标准参照2017 年世界卫生组织修订的《造血与淋巴组织肿瘤分类（第4版）》（中文译名）〔10〕，所有入选病例均为初诊病例，手术前均未经过化疗和放疗。纳入标准：①经活检组织病理学确诊为DLBCL 者；②临床病历资料完整者。排除标准：①并发其他恶性肿瘤者；②蜡块组织过少者；③年龄小于18 岁者。

1.2 试剂一抗为兔抗TEFM 抗体（Gene Tex 公司，克隆号：822004102）；Ki-67（批号：20220413）、Bcl-6（批号：20220719）、Bcl-2（批号：20220916）、DAB 显色试剂盒（批号：20220804）均购自福州迈新生物技术开发有限公司；二抗（批号：20210519）。

1.3 免疫组织化学方法3 μm 石蜡切片后68 ℃烤箱烘烤2 h，分别使用TO 透明（Ⅰ）、TO 透明（Ⅱ）脱蜡（各10 min），然后依次在无水乙醇（Ⅰ）、无水乙醇（Ⅱ）、95%乙醇（Ⅰ）、95%乙醇（Ⅱ）中浸润（各3 min），在85%乙醇中浸润2 min 后使用蒸馏水冲洗2 min。将切片放入乙二胺四乙酸缓冲液中高温修复抗原后滴加3%过氧化氢溶液于玻片中阻断内源性过氧化物酶活性，10 min 后使用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗3 次，每次冲洗5 min，滴加一抗，37 ℃孵育1 h；PBS 冲洗3 次，滴加二抗，37 ℃孵育30 min；PBS 冲洗3 次后DAB显色5 min，蒸馏水冲洗终止显色；使用Mayer 苏木素轻度复染细胞核3～5 min，蒸馏水冲洗后PBS 返蓝，冲洗脱水后吹干载玻片，中性树胶封片，PBS 代替一抗作为阴性对照。

1.4 判读标准Bcl-6、Bcl-2、TEFM 采用定性判断，随机选取10 个高倍视野，根据着色强度和视野中阳性细胞所占比例进行评分〔11〕。着色强度评分：无着色计0 分，浅黄色计1 分，棕黄色计2 分，棕褐色计3 分；阳性细胞所占比例评分：＜25%计1 分，25%～50%计2 分，＞50%计3 分。将着色强度评分和阳性细胞所占比例评分相乘：0～1 分为阴性，2～4分弱阳性，5～8 分为中等阳性，9～12 分强阳性，其中，阴性和弱阳性归为低表达，中等阳性和强阳性归为高表达。Ki-67 采用定量判定，将阳性细胞所占比例≥50%归为高表达，＜50%归为低表达。所有病理结果均经2 名以上病理学专家采用双盲法诊断。

1.5 统计分析采用SPSS 24.0 软件对数据进行统计分析，比较Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 蛋白在反应性增生淋巴组织与DLBCL 组织间的表达差异用χ2检验；探究Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 及TEFM 蛋白表达水平与DLBCL 临床病理特征的关系用χ2检验及Fisher 确切概率法；考察TEFM 与Ki-67、Bcl-6、Bcl-2表达的相关性用Spearman 秩相关分析，相关系数R＞0 表示正相关，R＜0 表示负相关，R=0 表示零相关，检验水准α=0.05，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表达情况对DLBCL 组织和反应性增生淋巴组织样本进行Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表达差异分析。结果显示，与反应性增生淋巴组织相比，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 蛋白在DLBCL 组织中高表达，差异有统计学意义（P＜0.05）；Ki-67、Bcl-6 和TEFM 定位于细胞核，Bcl-2 定位于细胞核及细胞质。在反应性增生淋巴组织中，Ki-67 仅在生发中心高表达，而DLBCL 由于淋巴结构被肿瘤细胞取代而遭到破坏，无正常淋巴结结构，和反应性增生淋巴组织相比，Ki-67 在肿瘤部位弥漫强阳性（≥75%）表达。在反应性增生淋巴组织中，Bcl-2 生发中心阴性，而在DLBCL 组织中可表现为弥漫阳性表达，成为非生发中心起源的标志物。在反应性增生淋巴组织中，Bcl-6 通常表达于生发中心，而在DLBCL 组织中，同样表现为弥漫阳性表达，是肿瘤细胞非生发中心起源的标志物。TEFM 蛋白在反应性增生淋巴组织中和DLBCL 中表达差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1、图1。

表1 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白在DLBCL 组织和反应性增生淋巴组织中的表达情况

图1 Bcl-2、Bcl-6、Ki-67 和TEFM 蛋白在反应性增生淋巴及DLBCL 组织中的表达情况

2.2 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表达水平与DLBCL 临床病理相关性分析通过对DLBCL 患者预后影响因素统计分析可知，DLBCL 患者Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表达水平与年龄、性别、B 症状、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）数值、结外器官受累情况及复发情况均无相关性（P ＞0.05），DLBCL 组织中TEFM 及Ki-67 蛋白表达水平与原发部位相关（P=0.049＜0.05）。见表2。

表2 Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 和TEFM 蛋白表达水平与DLBCL 临床病理相关性分析

2.3 TEFM 与Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表达的相关性分析通过统计分析TEFM 与Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表达的相关性可知，TEFM 蛋白表达与Ki-67、Bcl-6表达呈正相关（P＜0.05，R＞0）。见表3。

表3 TEFM 与Ki-67、Bcl-2、Bcl-6 表达的相关性分析

2.4 影响DLBCL 患者预后因素分析治疗结束后随访3 年，DLBCL 患者生存21 例，生存率为51.22%（21/41）。单因素分析结果显示，DLBCL 患者3 年生存率与性别、B 症状、LDH 数值、结外器官受累情况、复发情况和原发部位无相关性（P ＞0.05），与Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表达情况亦无相关性（P＞0.05），仅与患者年龄有相关性（P＜0.05），年龄≥60岁的患者生存率较低，仅为28.57%。见表4。

表4 影响DLBCL 患者预后因素分析

3 讨论

DLBCL 是非霍奇金淋巴瘤最常见的类型，多表现为单个或多个淋巴结或结外部位快速生长的异质性及侵袭性肿瘤。虽然大多数DLBCL 患者可以通过6～8 个周期的R-CHOP 化疗方案治愈，但仍有部分难治性复发患者。随着高通量测序和精准医学的发展，对DLBCL 形态学、免疫表型谱及分子发病机制的认识逐渐扩大，多种异常基因被发现，从分子水平研究有关预后和潜在治疗靶点标志物对于DLBCL 精准诊疗有重要指导意义。

Ki-67 蛋白是一种与肿瘤细胞增殖密切相关的核蛋白，存在于细胞周期的所有活跃阶段，但在静止细胞G0 期中不存在，目前Ki-67 的表达作为评价淋巴瘤增殖活性的指标已广泛应用于临床，Ki-67 与DLBCL 亚型相关的结果仍存在争议〔12-13〕。研究表明，Ki-67 表达水平是DLBCL 化疗患者不良生存率的一个预测因素〔14-16〕，Ki-67 高增殖指数（80%）与DLBCL 患者总体生存率缩短显著相关，与治疗不良反应相关性不显著〔17〕。周颖等〔18〕回顾性分析接受R-CHOP 化疗方案的DLBCL 患者Ki-67的表达及其与预后的相关性，结果表明Ki-67 低表达组的总生存时间（overall survival，OS）和无进展生存期（progression free survival，PFS）明显长于高表达组，Ki-67 的表达水平是影响OS 的独立预后因素。Tang 等〔19〕采用免疫组织化学方法检测了274例DLBCL 组织中Bcl-2 和Ki-67 的表达发现，Bcl-2/Ki-67 指数与DLBCL 患者的OS 和PFS 缩短显著相关，特别是对于生发中心B 淋巴细胞样亚型的DLBCL，Bcl-2 和Ki-67 共表达的患者生存率明显降低；Pǎtraçcu 等〔20〕同样发现Bcl-2、Ki-67 阴性表达患者的OS 和无病生存期较长。吴红卫等〔21〕分析58 例DLBCL 患者Ki-67 表达水平，结果显示Ki-67 表达水平与性别、年龄、LDH 数值、结外病变、临床分期及国际预后指数评分无关，Ki-67 高表达组与低表达组相比预后较差。

Bcl-2 是线粒体介导凋亡通路中的关键蛋白，具备稳定线粒体膜通透性作用，是一种抗凋亡分子，在静止的B 淋巴细胞和T 淋巴细胞上表达，但在正常的生发中心细胞上不表达〔22〕。Bcl-2 在22%～80%的DLBCL 中表达，Bcl-6 和Bcl-2 阳性率已被报道与不良预后相关〔23〕。在“双打击”淋巴瘤中以C-MYC、Bcl-2 基因同时异常最常见，C-MYC 及Bcl-2 基因异常表达可增强DLBCL 侵袭性，影响患者近期疗效和预后〔24〕。有研究〔25-28〕表明Bcl-2 蛋白可以作为DLBCL 患者预后因子，Bcl-2 和Bcl-6 在DLBCL 中高表达，Bcl-2 和Bcl-6 阳性表达与患者近期疗效与预后不良相关，对患者监测病情发展、治疗方案选择有现实意义〔29〕，Bcl-2 和Bcl-6 蛋白表达水平与DLBCL 患者的OS 和无病生存期显著相关〔30〕。基因扩增和易位是导致DLBCL 中Bcl-2蛋白过表达的共同机制，但Bcl-2 蛋白在DLBCL 中的表达及对患者生存率的影响仍存在争议。此外，Bcl-2 蛋白过表达对生发中心来源的DLBCL（GCBDLBCL）和活化B 淋巴细胞来源的DLBCL（ABCDLBCL）预后价值有所不同。Bcl-6 是一种编码95 kDa 的Kruppel 型锌指蛋白，Bcl-6 蛋白是成熟B 淋巴细胞在生发中心反应过程中所需的转录抑制因子，可影响淋巴滤泡生发中心B 淋巴细胞的反应和增生，对生发中心的发育和维持至关重要，而生发中心是产生有效的体液免疫反应所必需的。Bcl-6基因突变和染色体易位是肿瘤发生的基础，Bcl-6已成为DLBCL 的关键治疗靶点，其功能与Ki-67相似，Bcl-6 的异常表达可直接调节细胞的分化、增殖和细胞凋亡来影响DLBCL〔31〕。此外，Bcl-6 基因还通过调节其他基因（如C-MYC、信号转导及转录激活因子和Bcl-2）的表达来调节肿瘤的生长〔32-33〕。除Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表达水平与DLBCL 患者预后密切相关，Snuderl 等〔34〕认为年龄是影响患者预后的独立危险因素，高龄患者预后较差。本研究结果显示，DLBCL 组织中Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6 表达水平明显高于反应性增生淋巴组织，与既往研究〔30〕结果相符，进一步分析Ki-67、Bcl-2 和Bcl-6表达水平与影响DLBCL 患者预后的影响因素可知，三者的蛋白表达量与性别、年龄、B 症状、LDH数值、结外器官受累情况及复发情况均无相关性，Ki-67 蛋白表达水平与原发部位相关，结外表达水平高于结内，其内在联系及机制有待进一步探究。此外，单因素分析结果显示，DLBCL 患者3 年生存率与性别、B 症状、LDH 数值、结外器官受累情况、复发情况和原发部位均无相关性，仅与患者年龄有相关性，年龄≥60 岁的患者3 年生存率较低，与既往文献〔34〕报道一致。

TEFM 是线粒体基因转录调控中的重要蛋白因子，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，在线粒体基因转录调控中发挥重要调节作用〔8〕。研究〔19，35-36〕提示TEFM 基因在细胞内的功能可能类似于细胞癌基因，有研究结果表明，肝癌组织中TEFM 蛋白和mRNA 表达水平显著上调，且TEFM 基因的高表达与预后不良相关，此外TEFM mRNA 表达水平与性别、血清甲胎蛋白水平、血管浸润程度显著相关〔35〕。Wan 等〔36〕研究表明TEFM 是促进肝癌生长和转移的重要致癌基因，TEFM 表达升高通过激活ROS/ERK 信号促进肝癌细胞生长和转移，其表达水平增加与肝癌患者预后不良有关。TEFM 基因在DLBCL中的表达水平如何，以及是否与其他肿瘤增殖因子如Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 相互作用共同参与DLBCL发生、发展目前尚无文献报道。本研究结果显示，DLBCL 组织与反应性增生淋巴组织样本中的TEFM 表达水平差异无统计学意义，进一步分析TEFM 表达水平与影响DLBCL 患者预后的影响因素可知，其蛋白表达量与性别、年龄、B 症状、LDH数值、结外器官受累情况及复发情况均无相关性，TEFM 表达水平与原发部位相关，具体原因有待进一步考究，且TEFM 表达与Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 表达呈正相关，三者的异常表达如何调节细胞的分化、增殖和细胞凋亡来影响DLBCL 有待后续进一步研究。由于本研究样本量有限，在大样本中是否存在这样的内在联系及其内在机制有待进一步更深入的探讨。是否可以通过检测TEFM 的表达情况，为DLBCL 患者寻找新治疗方案提供理论依据仍需进一步研究。

综上所述，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 在DLBCL 患者中高表达，TEFM 表达与Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 在DLBCL 进展的过程中可能具有协同作用，Ki-67、Bcl-6、Bcl-2 可作为DLBCL 预后不良的重要指标，也可作为预测患者预后的有效指标。DLBCL 的精准治疗依赖于分子标志物的指导，随着高通量技术的飞速发展，对于DLBCL 疗效和预后分子标志物的多项研究均取得了不错的成果。DLBCL 作为高度异质性的恶性肿瘤，目前常规病理检测往往不能为临床治疗提供足够的信息，将传统临床病理因素与新型生物标志物联合起来，对于研究DLBCL 发生、发展中的分子机制及精准靶向诊疗有重要意义。