四川省凉山地区高风险人乳头瘤病毒亚型分布研究

陈华秋，陈兴友，王光明

（1.西昌市人民医院检验科，四川西昌 615000；2.西昌市人民医院病理科，四川西昌 615000；3.大理大学第一附属医院基因检测中心，云南大理 671000）

宫颈癌是一种常见的妇科恶性肿瘤〔1〕，严重威胁着女性的健康。宫颈癌每年确诊病例多达50 多万例，死于宫颈癌人数超过30 万人〔2〕。据报道，近年来宫颈癌的发病率有所下降，但仍然是导致发展中国家妇女癌症病死的主要原因〔3〕，中国和印度患者数量占全球宫颈癌患者的三分之一以上〔4〕。宫颈癌的形成是一个长期的过程，在发展成为浸润性宫颈癌之前很难被发现〔5〕。宫颈癌早期及时应用手术治疗，病情能得到有效控制，但到了中晚期则只能以放疗和化疗为主，且治疗效果并不理想〔6-7〕。人乳头瘤病毒（human papilloma virus，HPV）的感染与宫颈癌的发生密切相关〔8〕，根据其与宫颈癌和癌前病变的关系，分为高风险人乳头瘤病毒（high riskhuman papilloma virus，HR-HPV）和低风险人乳头瘤病毒（low risk-human papilloma virus，LR-HPV），不同HPV 亚型对宫颈组织损伤不同，宫颈癌的发生与HR-HPV 感染具有相关性，LR-HPV 与宫颈细胞的良性或低级别变化相关〔9-10〕。宫颈癌是唯一一种可以通过筛查来预防的恶性肿瘤，近年来，许多发达国家宫颈癌的发病率和病死率得到改善，这都归功于宫颈癌筛查和HPV 疫苗的普及。与欧洲国家相比，中国人群对HPV 疫苗的认识度相对较低〔8〕。研究〔11〕证明，年轻女性接种HPV 疫苗，益处可能比以前了解的还要多。HR-HPV 流行特点在不同的地理位置、经济水平和种族之间存在较为显著的差异〔12〕，因此研究四川省凉山地区的HR-HPV 感染特点，利于有针对性地开发该地区的HPV 疫苗，对宫颈癌的有效预防具有重要意义。本研究对四川省凉山地区7 445 例女性患者HR-HPV 的感染情况进行分析，总结该地区女性HR-HPV 感染特点，为该地区HR-HPV 疫苗的开发和宫颈癌的预防提供参考。

1 对象与方法

1.1 研究对象选取2018 年11 月14 日至2020年12 月30 日在西昌市人民医院体检中心和妇产科门诊就诊的7 445 例女性为研究对象，年龄16～86 岁，对各年龄段HR-HPV 感染情况、感染特点和亚型感染分布情况进行分析。本研究经西昌市人民医院医学伦理委员会审批通过，所有纳入研究者均签署知情同意书。

1.2 标本采集检查前要求：检查应在非月经期，48 h 内不应有性行为，3 d 内不应进行阴道冲洗或使用避孕药膏等阴道内用药。样本采集：使用一次性宫颈细胞采集器进行样本采集，采样前用棉拭子拭去宫颈口过多的分泌物，将宫颈刷置于宫颈口，轻轻搓动宫颈刷使其顺时针旋转3～4 圈，慢慢取出宫颈刷，将其放入装有细胞保存液的无菌样本管中，在管口处将多余的刷柄折断，密闭送检。标本保存和运送：采集样本的检测时限为室温（20 ℃）放置不超过24 h，4 ℃环境下放置不超过120 h，-20 ℃环境下放置不超过7 个月（反复冻融不超过7 次）；标本运送采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封运输。

1.3 仪器和试剂荧光定量PCR 仪（SLAN-96P，上海宏石）；高风险人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒（PCR-荧光探针法，湖南圣湘生物科技有限公司），该试剂盒用于体外定性检测女性宫颈脱落上皮细胞样本中的15 种HR-HPV 核酸DNA，并鉴别其基因亚型，分别为HPV 16 型、18 型、31 型、33型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、58型、59 型、66 型和68 型。

1.4 检测原理高风险人乳头瘤病毒核酸分型检测试剂盒采用核酸释放剂快速裂解、释放样本中HPV 的DNA，采用HPV 中15 种型别的特异性荧光引物及荧光探针，应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）结合Taqman 技术，分别对HPV 中15 种型别的特异性DNA 片段进行分型检测。整个实验过程无须单独提取样本中的DNA，只需将样本洗脱液直接与核酸释放剂充分混合即可作为PCR 扩增模板，可有效避免常规核酸提取过程中的环境污染。

1.5 检测流程严格按照试剂盒说明书进行操作，试剂准备：取出试剂盒中的各个组分，室温放置，待其温度平衡至室温，混匀后备用；取4 种HPV 的PCR 反应液n×38 μL 分别与4 份n×2 μL 酶混合液（n=待检样本数+质控品数，本研究中质控品为2个），充分混匀制成PCR-混合液，瞬时离心后备用。待测样本处理：1 mL 样本瞬时离心后吸取25 μL 至1.5 mL 灭菌离心管中，加入25 μL 核酸释放剂，充分混匀后作待测样本备用；将阴性对照和阳性对照分别进行稀释，取对照试剂25 μL 与核酸释放剂25 μL 混匀待用。加样：每个PCR 反应管中加入上述处理后的待测样本和稀释后的阴性对照、阳性对照各10 μL，间隔10 min 以上分别加入40 μL 上述已配制好的4 种PCR-混合液。PCR 扩增：将PCR反应管放入扩增仪样品槽，选择荧光检测通道、设定循环参数进行检测，并分析和判读检测结果。

1.6 统计分析采用SPSS 26.0 软件对数据进行统计分析，计数资料用［n（%）］表示，使用χ2检验进行差异分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 总体情况共有受检者7 445 例，其中HRHPV 阳性者1 027 例，阳性率为13.79%，HPV 16 型、18 型、31 型、33 型、35 型、39 型、45 型、51 型、52 型、53 型、56 型、58 型、59 型、66 型和68 型均有检出。

2.2 各年龄段HR-HPV 感染情况在7 445 例受检者中，以年龄≥61 岁的受检者HR-HPV 阳性率最高，其次为21～30 岁和51～60 岁的受检者，年龄≤20 岁的受检者HR-HPV 阳性率最低，不同年龄段受检者之间HR-HPV 阳性率比较差异有统计学意义（χ2=19.116，P=0.02＜0.05）。见表1。

表1 各年龄段HR-HPV 感染情况

2.3 单一感染与多重感染情况单一感染者818例（占79.65%），多重感染者209 例（占20.35%），差异有统计学意义（χ2=387.884，P＜0.01），由此可知，目前HPV 感染者中以单一感染情况为主。在多重感染者中，以感染2 个亚型的感染率最高，为15.00%（154/1 027），感染3 个亚型的感染率为4.19%（43/1 027），感染4 个亚型的感染率为0.97%（10/1 027），感染6 个亚型的感染率为0.19%（2/1 027）。

2.4 HR-HPV 亚型感染分布高危型单一感染比例最高的是HPV 52 型，阳性率为20.45%；其次为HPV 16 型，阳性率为8.28%；再次为HPV 53 型，阳性率为7.59%。结果发现，除了感染HPV 52 型与多重感染无关联外（P ＞0.05），其余单个亚型均与多重感染有关联（P＜0.05）。见表2。

表2 HR-HPV 亚型感染分布（n=1 027）

3 讨论

流行病学研究表明，持续HR-HPV 感染与发生高级别的宫颈上皮内癌变的风险呈正相关〔2，13〕，阳性者的风险是阴性者的100 多倍〔14〕。HPV 的阳性率从非典型鳞状细胞增生、低级别鳞状上皮细胞内瘤变、高级别鳞状上皮细胞内瘤变到浸润性宫颈癌呈上升趋势〔15〕。四川省凉山地区关于HPV 感染的报道较少，因此，本研究有助于丰富该地区HPV 感染的流行病学数据，使该地区的HPV 筛查和宫颈癌预防方案更有针对性。

本次研究中，HR-HPV 的阳性率为13.79%，阳性率最高的年龄段为≥61 岁（占22.39%）和21～30岁（占15.86%），阳性率最低的年龄段为≤20 岁（占9.52%）；单一感染者818 例（占79.65%），多重感染者209 例（占20.35%）；单一HR-HPV 感染中阳性率排名前3 的感染亚型分别为HPV 52 型（占20.45%）、16 型（占8.28%）、53 型（占7.59%）。在本研究中，年龄≤20 岁和年龄≥61 岁的病例数相对较少，不能真实反映该年龄段HR-HPV 感染的真实情况，因此，应加大四川省凉山地区这2 个年龄段女性HR-HPV 筛查的宣传力度。本研究结果表明，该地区HR-HPV 仍以单一感染为主，多重感染是否更容易引起宫颈病变以及对病变严重程度的影响仍存在争议，还有待进一步研究。

国内外关于HR-HPV 流行病学的报道中，阳性率最高的亚型和年龄段不尽相同。HPV 16 型、18 型是印度阳性率最高的亚型〔16〕，其中印度中央邦阿努普尔区HPV 16 型检出率高达到70.0%，随着年龄的增长其阳性率显著下降，排在前两位的年龄段分别为15～29 岁和30～54 岁，阳性率分别为86.4%和13.3%〔17〕；在墨西哥HR-HPV 阳性率排名前三的亚型分别为HPV 16 型、59 型和66 型，感染的高峰年龄为36～55 岁〔18〕；巴基斯坦最常见的HRHPV 亚型为HPV 16 型、18 型和45 型，HPV 阳性率高达57.0%，单一型HR-HPV 阳性率高达25.0%〔19〕。在我国，佛山市最常见的HR-HPV 亚型分别为HPV 16 型、52 型和58 型〔20〕；北京地区感染阳性率排名前三的HR-HPV 亚型依次为HPV 16 型、52 型和58 型，阳性率最高的年龄段为30～40 岁和45～55岁〔21〕；重庆市HR-HPV 感染阳性率排名前三的亚型分别为HPV 52 型、16 型和58 型，感染的高峰分别在20 岁以下和50 岁以上〔22〕；山西省感染阳性率排名前三的HR-HPV 亚型分别为HPV 16 型、58型和52 型，HR-HPV 的阳性率随着宫颈细胞学的严重程度呈上升趋势〔23〕；四川省HR-HPV 感染阳性率排名前三的亚型分别为HPV 52 型、58 型和16型〔24〕；全国HR-HPV 感染阳性率排名前三的亚型分别为HPV 52 型、53 型和58 型〔25〕。在本研究中，四川省凉山地区HPV 流行特点与很多地区不尽相同，可能与凉山地区是少数民族聚居地有关，本研究还发现50 岁以上女性的HR-HPV 阳性率很高，分析原因可能与此阶段女性处于绝经期，其雌性激素水平降低，阴道内环境发生改变有关。

综上所述，四川省凉山地区HR-HPV 感染的特殊性可能与该地区的地理位置和民族差异有关，本次研究丰富了HR-HPV 感染的流行病学研究，为该地区HPV 疫苗的开发，宫颈癌的预防提供有价值的数据支持。